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【摘要】目的探讨术中快速乙酰胆碱酯酶（AChE）染色法诊断先天性巨结肠（Hirschsprung's disease,HD）和肠神经元性发育异常Intestinal neuronal dysplasia,IND）的可行性及临床意义。方法选择10 例诊为HD并行手术治疗的患儿，术中切取病变肠段及吻合口处肠壁组织分别行快速及传统AChE染色检查，比较其诊断结果。结果两种染色方法相比无显著性差异。结论快速AChE染色法可行，是术中检查诊断HD和IND的有效辅助手段。
【关键词】先天性巨结肠；肠神经元性发育异常；术中诊断；临床评价
Evaluation of intraoperative AChE stainig method on diagnosing HD and IND
LIU YunjianLIU JunchengPAN Cuilinget al
Department of Pediatric Surgery,the First Affiliated Hospital of Sun Yatsen University,Guangzhou 510080,China
【Abstract】Objective To investigate the reliability and clinic significance of intraoperative rapid staining method in diagnosis of HD and IND. Methods Ten children with HD were operated on with resecting colon and rectum were examined with rapid AChE staining method and traditional AChE staining method. Results There is no significant difference between the two staining methods.ConclusionThe rapid AChE staining method is reliable for diagnosing HD and IND
【Key words】 HD,IND,intraoperative diagnosis, clinical evaluation
肠神经元性发育异常（IND）是先天性巨结肠类缘病（Hirschsprung's allied disease, HAD）中常见的类型，也是部分先天性巨结肠（HD）临床治疗效果欠佳的原因之一。如何在根治术前确诊患儿为单纯HD还是HD合并IND，从而进行合理的治疗仍是临床一大难题。本文旨在探索术中采用快速染色检查方法进行IND诊断的可能性。
1资料与方法
1.1一般资料2002 年 6 月至 2004 年 3 月选择 10 例根治术前诊为 HD 的患儿，术中切取病变肠段和吻合口处肠壁组织做标本，分别行传统及快速AChE染色检查，观察两种不同检查方法AChE阳性的显示情况，对照比较两种方法的染色情况。10 例患儿，男 7 例，女 3 例，最大年龄 4 岁，最小年龄 3 个月，平均年龄 14 个月。手术前均有顽固性便秘，临床诊断为HD。
1.2实验方法和步骤
1.2.1传统AChE染色法： 底物（硫化乙酰硫代胆碱）5 mg，依次加入蒸馏水1 ml﹑0.1 M PBS(磷酸盐缓冲液)6.5 ml﹑0.1 M柠檬酸钠液0.5 ml﹑30 mM硫酸铜液1 ml﹑5 mM铁氰化钾液1 ml﹑4 mM抑制剂（四异丙基焦磷酰胺）0.2 ml,然后将病理切片放入37℃孵育液中，留置 90 min，取出后苏木素染色 3 min，冲洗，烘干，中性树胶封片。
1.2.2快速AChE染色法步骤：和传统法相比，增加了底物量，为50 mg。孵育液配制步骤﹑其它试剂及用量相同，将配好的孵育液先放入37℃温箱预温 15 min以上，放入的病理切片留置 15 min，取出后水洗，加双氧水，5 min后再水洗，加DAB（二氨基联苯胺四盐酸盐）液，1 min后加双氧水，苏木素染色 3 min，以后步骤同传统法。
1.2.3诊断标准：根据肌间神经丛所见神经细胞的多少分4级［1］，标准如下：(－)全部神经丛内未见；(±)个别神经丛内见；(+)约1/3神经丛内见；()﹥1/2神经丛内见。
2结果
2.110 例患儿病变肠段组织行传统及快速AChE染色检查，结果均为(－)者7例，传统染色(－)快速染色(±)者1例，传统染色(±)快速染色(+)者1例，传统染色(+)快速染色()者1例，以配对秩和检验对两种方法比较，见表1。
表1病变肠段传统及快速AChE染色检查法结果比较方法（略）
2.210 例病儿肠吻合口处肠壁组织行传统及快速AChE染色检查，结果均为()者7例，传统染色()快速染色(+)者1例，传统染色(+)快速染色(±)者2例，用配对秩和检验对两种方法比较，见表2。
表2肠吻合口处传统及快速AChE染色检查法结果比较方法（略）注：配对秩和检验：Z=1. 732，P=0. 083。
3讨论
3.1先天性巨结肠与先天性巨结肠类缘病在临床实践中不断遇见非HD而临床表现酷似HD的病例，按HD来医治，治疗效果往往不理想。目前认为临床表现类似HD的，仅50%是典型的神经节细胞缺乏症［2］，因此HAD具有相当的普遍性，目前认为肠神经异常是小儿便秘的主要原因［3～5］。类缘病可单独发病（单纯型），但多数与HD合并存在（混合型），表现为无神经节细胞肠段以上的肠管存在着类缘病的病理改变；其中以IND最为多见，文献报道高达40%的HD病人合并有IND。若仅切除无神经节肠段而保留了存在类缘病的肠段，手术后仍会出现便秘、反复发作肠炎等，因此类缘病尤其是IND被认为是HD术后症状复发的重要原因。术中有效诊断出HD近端合并类缘病，确立类缘病病变程度与肠动力正常与否的关系，以确保HD术后避免症状复发以及小肠结肠炎等其它合并症，是现今小儿外科在HD治疗方面迫切需要解决的问题。这一问题的解决将会使传统的HD手术治疗效果得到进一步提高，同时也为类缘病的手术治疗提供可靠的依据。
3.2AChE染色作用正常人肠壁粘膜的固有膜内AChE阳性神经不能显示，但HD患儿肠壁粘膜固有层AChE阳性神经经过染色可显示，这已在临床广泛应用。目前认为类缘病存在肠肌层神经肌接头（neuromuscular conjunctions,NMJ）的异常，表现为突触素（synaptophysin,SY）的免疫活性降低；由于IND同HD一样均表现为副交感神经发育异常，因此AChE染色和SY免疫组化染色被用于诊断类缘病。IND患儿肠壁粘膜固有层﹑粘膜下层神经纤维增生，AChE染色可使肠壁粘膜的固有膜内AChE阳性神经显示，同时还可以显示肌间神经丛和神经节的数目﹑分布及增生情况，还可以对孤立的神经节细胞和异位神经节细胞清楚地显示，故AChE染色不但可诊断HD，而且对诊断IND有明显的优势［６］。
3.3术中快速AChE染色检查的意义一方面需要在根治术前或术中能诊断出类缘病，特别是IND，另一方面传统的AChE染色又不能满足需要。一般说来，IND的诊断主要依靠肠壁全层病理检查确诊。依靠传统AChE染色，虽可以对IND做出诊断，但这种诊断仅仅是在术后做出，不能对IND治疗方案的制订作出正确的指导，导致手术效果欠佳，并发症较多。有人主张腹腔镜辅助活检是一个可靠的方法［７］，但该方法既增加了手术的次数，又增加了住院的费用和患儿的痛苦。故改进AChE染色法，缩短染片的时间，很有必要。研究表明，术中快速AChE染色检查法和传统AChE染色检查法相比，时间缩短而结果无显著性差异，这就为在根治术时进行此项染色检查，以便及时得出正确的诊断，从而使治疗更合理提供了依据。该方法用来诊断HD及HD合并IND是可行的，其结果是可靠的，值得临床推广应用。当然，由于该研究样本量有限，很多问题还需进一步研究。
参考文献
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2. Holschneider AM, Meier-Ruge W, Ure BM. Hirschsprung's disease and allied disorders-a review［Ｊ］. Eur J Pediatr Surg,1994,(4):260
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6. 凌启波. 实用病理特殊染色和组化技术［M］. 广州: 广东高等教育出版社，1989.288~292
7. Carvalho JL,Campos M, Soares-Oliveira M, et al. Laproscopic colonic mapping of dysganglionosis［Ｊ］. Pediatr Surg Int,2001,17:493
1 中山大学附属第一医院小儿外科广州市510080；2 中山大学附属第一医院病理科；
3 滨州医学院附属医院临床营养中心
基金项目：广东省卫生厅基金资助项目（编号：A2003175）