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摘要:目的 克隆家蝇Ace基因并进行表达，并对家蝇AChE序列进行分析，为利用基因工程进行酶改造提供必要的参考。 方法 结合已有的文献资料，利用生物信息学方法对家蝇AChE的序列进行分析，包括密码子偏爱性、系统发生、三维结构预测等。 结果 成功克隆家蝇Ace基因，并利用同源模建方法获得了家蝇AChE的三维结构，以果蝇AChE为参考，判断了家蝇AChE应属于AChE2家族。 结论 根据所得家蝇AChE的三维模型从理论上分析了因AChE中一个氨基酸突变导致家蝇产生有机磷抗性的可能原因，并为半理性改造家蝇乙酰胆碱酯酶提供了三维模型。
关键词:乙酰胆碱酯酶;序列分析;进化树;三维结构;同源模建
Cloning and sequence analysis of AChE gene from Housefly（Musca domestica）.
FANG Xiao-dong，HUANG Jun-sheng.
（State Key Biotchnology Laboratory for Tropical Crops Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou571101，Hainan，P.R.China）
Abstract:Objective To clone acetylcholinesterase（AChE）gene from Housefly（Musca domestica）in order to provide neces-sary reference for genetic engineering study. Methods The sequence of AchE was，by means of bioinformatics，analyzed in-cluding codon bias，systemic genesis，predicting of three-dimentional structure by using bioinformatics.Results AChE gene from housefly was cloned and AChE three-dimentional structure was obtained by homologous modeling.AChE，belonged to AChE2fami-ly，from fruitfly was taken as reference. Conclusion Based on housefly's AChE three-dimentional structure it is theoretically in-dicating the possibility that a mutation of an amino acid in Housefly's AChE can lead to the resistance of housefly to organic phospho-rus pesticide.
Key words:Acetylcholinesterase;Sequence analysis;Three-dimentional structure;Homologous modeling
乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7）是生物神经传导中的一种关键酶，主要存在于神经元和神经肌肉接头处 ［1，2］ ，为膜结合蛋白，定位于细胞膜和突触前后膜，能快速水解神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）从而终止ACh对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性 ［3］ 。
乙酰胆碱酯酶可用于对部分农药进行残留速测，其操作简便、易行、成本低、前期投入少，适用于有机磷与氨基甲酸酯类农药，根据有机磷与氨基甲酸酯类农药使昆虫中毒致死的毒力学原理，将乙酰胆碱酯酶与样品反应，根据乙酰胆碱酯酶活性受到抑制的情况所产生的颜色变化，可判断出样品中是否含有超标的有机磷或氨基甲酸酯类农药。酶抑制法广泛应用对现场检测成效显著，成为仪器分析法的有效补充，但目前所用的AChE主要来自组织或血液提取，成本高，成分杂，影响了推广。本研究通过克隆家蝇Ace基因，构建高效表达AChE的工程菌，并通过对家蝇AChE的一系列分析确定突变位点，再进行定点突变，期望能够提高重组蛋白的酶活性和稳定性。
1 材料与方法
1.1 家蝇Ace基因的克隆 根据NCBI上登录的家蝇ace基因序列，并根据所要采取的表达载体的多克隆位点（MCS）设计引物。在正向克隆引物（22bF）的5'加上BamH I位点，在反向引物（22bR）的5'加上Xho I位点，由于PET22b的阅读框架是+2，所以在正向引物的BamH I位点的3'末端加上一个G以保证正确的阅读框架。
正向引物22bF 5'-GGATCC G ATGACAGATCATCTAACG反向引物22bR 5'-CTCGAG TTGGAAAATGCTATTGAC为进行酵母表达，选择pGAPZαA和pPICZαA这两个表达载体，根据两者的MCS特点，在正向克隆引物（ppF）的5'加上Xho I位点，在反向引物（ppR）的5'加上Xba I位点，这对引物同时适用于pGAPZαA和pPICZαA。
正向引物ppF 5'-CTCGAGaaaagagagATGACAGATCAT CTAAC反向引物ppR 5'-TCTAGATTGGAAAATGCTATTGAC。
用异硫氰酸弧法提取家蝇总RNA，进行RT-PCR，对得到的PCR产物进行TA克隆，通过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆进行菌落PCR和酶切鉴定并测序。
1.2 Ace基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析 一般来说，在大杆菌表达系统中，如果表达序列中的GC含量超过70%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平，目的蛋白小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。另外，密码子偏爱性的差异也可能是能否顺利表达的一个限制因素，因此有必要对目的蛋白进行相关分析。
1.2.1 核苷酸序列基本信息 用Informax公司的Vector NTI9.0分析可以得到序列的基本信息。并利用http://gcua.schoedl.de/ ［4］ 网站所提供的在线服务对家蝇Ace基因的进行密码子偏爱性分析。
1.2.2 AChE的多序列比对 将家蝇与其他物种的AChE（Electrophorus electricus、Torpedo californica、Musca domestica、Drosophila melanogaster、Mus musculus、Homo sapiens）作做多序列比对。通过和其他一些已知该酶三维结构的物种做多序列比对分析可以更多了解家蝇AChE的进化关系、序列与功能的关系。
1.2.3 AChE的分子进化分析 从ESTHER Database ［9］ 数据库获得来自38个种45个AChE序列，利用MEGA3.0构建了AChE的分子进化树。在MEGA中先用Clustal W命令做多序列比对，其中做两两比对时空位罚分为10，空位延伸罚分为0.1。最后多序列比对时空位罚分为10，空位延伸罚分为0.2。再用邻位相邻法构建分子进化树，并检测了进化树的健壮性（Bootstap1050）。
1.2.4 三级结构预测 Swiss PDV Viewer（DeepView）与Swiss-Model服务器紧密关联，可以从软件直接连到Swiss-Model服务器进行理论蛋白质立体结构构建 ［10，11］ 。在DeepView里导入FASTA格式的家蝇AChE蛋白质序列并向服务器请求模建，经过服务器的一系列运算后，获得一个包以含果蝇AChE作为模建模板和目标模型的工程文件，并在Deepview里打开，经过能量最小化和手工调整后通过Sumit modeling request命令请求对所得模型建立缺失的无规则卷曲并完善侧链装配。
2 结果与分析
2.1 家蝇Ace基因克隆和表达的确认 对所得RT-PCR产物电泳检测，如图1所示，1号泳道为22bF和22bR得到的PCR产物，2号泳道为ppF和ppR得到的PCR产物，Marker为DL2000，从图中看出条带大约为1.8K，与预期一致，并经测序表明成功克隆了家蝇Ace基因。
2.2 从Vector NTI中可以知道基因的DNA序列全长1836bp，分子量为1193.4kDa。其中含G碱基446个，T碱基480个，A碱基506个，C碱基404个。GC含量为46%，AT含量为54%。密码子偏爱性分析结果表明家蝇Ace基因的密码子偏爱性和大肠杆菌表、酵母的均数差都在12%到13%之间，因此可以初步选择大肠杆菌表达系统或酵母表达系统来表达外源蛋白。但由于AChE是糖蛋白，存在着翻译后修饰，所以最好是选择真核表达系统，如酵母表达系统等。
2.3 多序列比对结果表明不同物种的AChE序列有高度的相似性，并且在已知功能的氨基酸位点都高度一致，所以，已知三级结构的AChE为同源模建家蝇AChE的三级结构奠定了重要基础，可以为解析家蝇的AChE结构和功能的关系提供了有价值的参考意见。
2.4 获得AChE的进化树如图2所示，从进化树中可以看到所有的序列被分成两组:脊椎动物（红色线条）和非脊椎动物（蓝色线条）。昆虫的AChE又被分为两组:昆虫AChE1和昆虫AChE2。其中Culex pipiens、Culex tritaeniorhynchus、Anopheles gambiae、Apis mellifera、Myzus persicae、Sitobion avenae、Aphis gossypii等物种既有AChE1又有AChE2。如果以果蝇（Drosophila melanogaster）为参照，则AChE1为果蝇的旁系同源基因编码产物（Paralogous），AChE2为果蝇的直系同源基因编 码产物（Orthologous），从所构建的分子进化树中可以看出，家蝇（Musca domestica）的AChE应该属于AChE2。
2.5 通过同源模建得到了家蝇AChE的三维模型 家蝇AChE的三维结构中，球棒模型显示的为活性位点S235、E364、H447及乙酰结合位点W83。其他氨基酸残基用带状表示，并从N末端到C末端的顺序（颜色从蓝色到红色过渡）对二级结构进行着色见图3～4。可以明显地看到一个底物进入活性中心的口袋状空隙。
图1 RT-PCR得到的PCR产物电泳图（略）
图2 用MEGA3.0构建的来自于ESTHER Database的38个种的45个AChE序列的分子进化树。所有的序列被分成两组:脊椎动物（红色线条）和非脊椎动物（蓝色线条）。昆虫的AChE又被分为两组:昆虫AChE1和昆虫AChE2。这些物种分别是:Aedes Aegypti，Anopheles gambiae，Anopheles stephensi，Aphis gossypii，Apis mellifera，Bactrocera dorsalis，Bactrocera oleae，Bemisia tabaci，Bungarus fasciatus，Canis familiaris，Carassius auratus，Culex pipiens，Culex tritaeniorhynchus，Danio rerio，Drosophila melanogaster，Electrophorus electricus，Felis catus，Helicoverpa armigera，Helicoverpa assulta，Homo sapiens，Lucilia cuprina，Macaca mulatta，Mus musculus，Musca domestica，Myzus persicae，Nephotettix cincticeps，Nilaparvata lugens，Plutella xylostella，Oryctolagus cuniculus，Rattus norvegicus，Rhopalosiphum padi，Sitobion avenae，Torpedo californica，Torpedo marmorata，Trialeurodes vaporariorum，Xenopus tropicalis。（略）
图3 球棒模型显示的为活性位点及乙酰结合位点。图中白色箭头所指为活性位点和底物进入活性位点必经的口袋状通道（略）
图4 以Slab方式显示的结构图。右图为G262A突变后的结构图，图中黄色箭头所示为Gly突变为Ala后引入的甲基;左图为突变前的结构图。（略）
3 讨论
从多序列比对中要以看出，FGESAG为乙酰胆碱酯酶的保守序列，有文献报道当这些位置的氨基酸突变为其他氨基酸时会表现出不同的有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂抗性 ［5］ ，可见其对维持AChE三维构象有重要作用。多序列比对显示脊椎动物和非脊椎动物的AChE酶在靠近N末端的地方存在着一个长达31个碱基的空位，R110-P140，有文献报导该序列是双翅目特有的亲水氨基酸序列，存着于酶的表面 ［6，7］ 。酶活性催化中心有由三个氨基酸所构成的催化三联体单元，是具有活性的AChE所必需的，分别是丝氨酸、组氨酸和谷氨酸。当将其中任意一个突变为Ala后，酶的表达量并不降低，但是却丧失了酶的催化活性 ［8］ 。从比对结果中可以看出，活性位点的Ser、Glu、His包括乙酰结合位点Trp等氨基酸在不同物种中都一致。
Chung-Sei等分析了对有机磷有抗性的家蝇AChE后发现其中存在着一个G262A突变，将Ala突变成Gly后恢复了对有机磷农药的敏感性，表明了G262A突变使家蝇获得有机磷抗性 ［5］ 。从上面的多序列比对中可以看出，在不同特种中的AChE中G262都是保守的，说明G262可能对维持酶构象有重要作用。在Deepview里对G262进行模拟突变，由于Gly的R基团为H，不受角度限制，而突变成Ala后引入了甲基。从模型中可以看出Gly突变成其他基团时都引入了不同的R基团，该基团与AChE的活性位点Ser的距离很近，并且朝向Ser，所以新引入的基团可能会对Ser的原子排列产生作用力，从而导致酶活性位点的三维结构产生了变化，使酶功能引起变化。如图4所示，S235，E364，H447和W83，G262以球棍模型，其他氨基酸以带状形式表示。 通过对家蝇Ace基因及其推导的编码蛋白质进行了一系列的初步分析，更加系统地了解家蝇AChE的一些特性。
结构与功能有密切的联系，通过预测家蝇AChE的三维结构可以更好地为突变实验进行指导。蛋白质同源模建方法是进行蛋白质结构预测较为可靠的方法，所得到的结构模型可用于蛋白质结构、功能分析及药物设计等。通过同源模建后可以分析不同位点的氨基酸或氨基酸组合在维持AChE三维结构及功能的联系，提供了一个更直观地分析构效关系的模型，并在模型的基础上分析了一个客观存在的因AChE的一个氨基酸突变而使家蝇获得有机磷农药抗性的可能原因。比较不同昆虫和哺乳动物的AChE结构上的细微差别可以为设计只针对昆虫有毒性而对人和家畜无毒性或弱毒性的新型农药提供有益参考。也可以在以上分析的基础上模拟点突变并进行理论分析，判断一些可能会增强酶活性和稳定性的突变位点，并进行表达分析，期望获得有更高AChE活性和灵敏性，从而可以提高检测农药残留的敏感性，降低检出浓度，为保障人民的食品安全提供一个可选方法。通过模型的构效分析，为基因工程良酶提供参考和依据，具有很大的理论价值和实际价值。
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