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【摘要】 目的 研究中药榄香烯对人宫颈癌细胞Hela的体外抑瘤效应及其作用机制。方法 应用MTT比色法观察榄香烯对细胞的生长抑制作用；DNA凝胶电泳和流式细胞术等分析细胞凋亡、周期变化及Bcl2蛋白表达情况。结果 榄香烯对Hela细胞有较强的体外增殖抑制作用。榄香烯能诱导Hela细胞凋亡，同时伴随有Bcl2蛋白表达下调。结论 榄香烯对Hela细胞有较强的抗瘤效应，可能与Bcl2蛋白下调引起的细胞凋亡有关。
【关键词】 榄香烯；凋亡；Hela细胞；Bcl2蛋白
Cylostatic of action elemene on human cervix cancer Hela cells
YU Rong LIU Qingling ZHAO Dongmei
Yantai Yuhuangding Hospital，Laishan Branch，Yantai 264003；Binzhou Medical College
【Abstract】 Objective To study cylostatic action and the mechanism of elemene on human cervix cancer Hela cells.Methods Hela cells were treated with elemene at different concentrations.The growth inhibition was analysed by MTT assay，cell apoptosis by flow cytometry and agarose gel electrophoresis.Results Elemene remarkably inhibited the growth of Hela cells.Elemene could induce apoptosis and regulate expression of Bcl2 protein in Hela cells.Conclusion Elemene can inhibit human cervix cancer Hela cells,which is related with apoptosis induced by decrement of Bcl2 protein expression.
【Key words】 elemene，apoptosis，Hela cells，Bcl2 protein
榄香烯（elemene）属于不含氧的倍半烯烃类，系由中药温莪术挥发油中分离出来的油状物单体，属国家二类抗癌新药［1］。其疗效好，对肝肾脑等重要器官无毒副作用［2，3］，具有广泛的应用前景。本文以人宫颈癌细胞株Hela为模型来探讨榄香烯对其的作用机制，以便对肿瘤治疗提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料 人宫颈癌细胞株Hela购自中科院上海细胞所细胞库。榄香烯，大连金港制药有限公司产品；MTT、DMSO均为Sigma公司产品；RPMI1640为Gibco公司产品。
1.2 细胞培养 将人宫颈癌细胞株Hela以含10%胎牛血清的RPMI1640（含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml）在37℃，5%CO2孵育箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 细胞增殖抑制试验 取对数生长期的Hela细胞接种于96孔培养板（细胞数为5×104/孔，100 μl/孔），加入不同浓度的榄香烯，使其终浓度分别为0，25，50，100，200，400 μg/ml，最后用培养基补充至每孔200 μl，5%CO2孵箱中培养72 h后每孔加入MTT溶液（5g/L）20 μl，继续培养4 h后，1000 r/min，弃去孔内培养基，每孔加入150 μl DMSO，37℃温摇10 min，使其充分溶解，酶联检测仪570 nm波长处测定吸收度A值。抑制率（%）=［（A对照-A实验）/（A对照-A空白）］×100，并求其IC50值。
1.4 流式细胞仪检测细胞周期变化 收集200 μg/ml榄香烯作用不同时间的细胞，用PBS离心洗涤两次，弃上清，加入70%乙醇10 ml，上机前离心洗涤制成单细胞悬液，加PI染色，暗室放置，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.5 凝胶电泳检测凋亡梯度 收集不同浓度榄香烯作用72 h的细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，001 mol/L PBS洗1次。1000 r/min离心5 min，弃上清，用2 ml TE溶解细胞沉淀，加10%SDS 200 μl，混匀后再加入1%蛋白酶K 20 μl，37℃过夜。次日用酚氯仿抽提基因组DNA，行1%琼脂糖凝胶电泳，50 V电泳3 h，紫外灯下照相。
1.6 Bcl2蛋白水平检测 收集不同浓度榄香烯作用48 h的Hela细胞，PBS离心洗涤2次，甲醛固定，再用PBS配制的Staing缓冲液（2%AB人血清，01%NaN3）洗涤，离心，弃上清，置-20℃冷冻过夜，在冷冻的细胞内加入PBS配制的TB穿透液，加入Bcl2多抗（兔抗人）工作液40 μl，4℃ 30 min，PBS洗掉Bcl2多抗，流式细胞仪检测。
1.7 统计学处理 样本均数的比较采用Dunnett检验。
2 结果
2.1 榄香烯对细胞增殖的抑制作用 榄香烯25~400 μg/ml作用72 h对Hela细胞体外增殖有显著的抑制作用，呈剂量依赖性（表1），求其IC50值为2135 μg/ml，1346 μg/ml。
表1 榄香烯对Hela细胞增殖抑制作用（略）
2.2 流式细胞术分析榄香烯对细胞周期的影响 200 μg/ml榄香烯作用于Hela细胞，当作用6 h后，G1期细胞稍下降，S期细胞逐渐增多；作用12 h后，S期细胞发生阻滞；作用24 h后，亚G1期细胞显著增多（表2），出现明显的亚二倍体峰。上述结果表明，榄香烯对Hela细胞周期有着明显影响，主要是阻滞细胞周期中S期向G2/M期的转变过程，减少有丝分裂，并引起细胞凋亡。
表2 榄香烯对Hela细胞周期的影响（略）
2.3 Bcl2蛋白水平检测 随着榄香烯浓度逐渐增加，Bcl2蛋白表达的阳性细胞百分率逐渐减低（表3）。
表3 榄香烯作用过的Hela细胞中Bcl2蛋白表达（略）
3 讨论
榄香烯是一种国家二类抗癌药物，实验药理学及临床药理学都证实该制剂对多种肿瘤细胞有确切疗效。本实验在以往报道基础上，以人宫颈癌细胞Hela为模型，采用MTT、FACS、凝胶电泳等方法对榄香烯作用过的Hela细胞进行研究。结果表明，榄香烯对Hela细胞的体外增殖有明显抑制作用，且呈明显的时间和剂量依赖性。另外，对细胞周期变化分析表明，榄香烯能阻滞Hela细胞从S期向G2/M期的变化，减少有丝分裂，从而抑制细胞生长。这与以往的报道相吻合［4，5］，同时也提示榄香烯对不同细胞株可能有着共同的体外增殖抑制作用和机制，为榄香烯在临床上与其它药物的联合化疗提供了理论依据；另外，处于分裂期的细胞比其它期的细胞对放疗更为敏感，所以使用榄香烯后联合放疗可使肿瘤患者获得更好的治疗效果。
典型的DNA“梯形”条带、亚二倍体峰的出现均证实榄香烯能诱导Hela细胞凋亡。由于是发生于G2/M期阻滞之后，表明G2/M期阻滞可能是榄香烯诱导细胞凋亡的重要因素。流式细胞术对Bcl2蛋白水平表达检测分析表明，在榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡时伴随有Bcl2蛋白水平表达的下调。Bcl2是抗凋亡基因，其下调有利于降低肿瘤细胞对放化疗的抗性，利于诱导凋亡［6］，所以，Bcl2下调在榄香烯诱导Hela细胞凋亡过程中也是一个重要因素。
另有报道［7］，榄香烯在诱导肝癌细胞株SMMC7721凋亡同时也有cmyc蛋白降低和p53蛋白升高的现象，说明榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡也与cmyc及p53表达变化有关。当然，凋亡是一个极其复杂的生物学过程，影响因素众多，就榄香烯诱导凋亡时各因素之间的关系目前尚无定论。因而，进一步探讨榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，将对肿瘤的发生及治疗起积极作用。
参考文献
1.时继慧，李成章，刘德兰，等.温莪术挥发油的实验药理研究—β榄香烯的抗瘤作用的研究［J］.中药通报，1981，6：36
2.Yang H，Wang XP，Yu LL，et al.The antitumor activity of elemene is associated with apoptosis［J］.Chin J Oncol，1996，18：169
3. Wang JW，Zhang HP，Sun Y.Phase Ⅲ clinical trial of elemene emulsion in the management of malignant pleural and peritoneal effusion［J］.Chin J Oncol，1996，18:464
4.Yuan J，Gu ZL，Chou WH，et al.Elemene induces apoptosis and regulates expression of bcl2 protein in human leukemia K562 cells［J］.Acta Pharmacologica Sinia，1999，20（2）：103
5.杨骅，王仙平，郁琳琳，等.榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞凋亡［J］.中华肿瘤杂志，1996，18（3）：169
6.Reed JC.Bcl2 and the regulation of programmed cell death［J］.J Cell Biol，1994，124：1
7.徐学军，周子成，罗元辉，等.β榄香烯诱导人肝癌细胞株SMMC7721凋亡的研究［J］.第三军医大学学报，1999，21（4）：46
烟台毓璜顶医院莱山分院妇产科 烟台市 264003；滨州医学院解剖学教研室