山茱萸提取物对肾阳虚大鼠下丘脑垂体肾上腺皮质轴的影响

【摘要】  目的 探讨山茱萸提取物的补肾阳作用。方法 应用外源性糖皮质激素所致的肾阳虚动物模型，观察山茱萸提取物对肾阳虚大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）分泌及钙调蛋白（CaM）mRNA表达的影响。结果 山茱萸提取物使肾阳虚大鼠下丘脑CaM mRNA的表达量减少，CRH分泌增多。结论 山茱萸提取物具有较显著的补益肾阳功效。

【关键词】  山茱萸提取物 肾阳虚 钙调蛋白 下丘脑 促肾上腺皮质激素释放激素

    Effects of the extract of Fructus Corni on secretion of corticotrophinreleasing hormone(CRH) in

    the hypothalamus of animals with  kidneyyang deficiency

    JIANG Shujun  SUN Jianrong  Wang Tao  et al

    Department of Physiology ,Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    【Abstract】  Objective  To explore effects of extra of  Fructus Corni (FCE) on tonifying kidneyyang．Methods  The animal  model of kidneyyang deficiency with the hydrocortisone was made by exogenous glucocorticoid．Effects of  the extract of Fructus Corni  on the kidneyyang deficiency rats was observed.Results  The  FCE can decrease the levels of calmodulin(CaM) mRNA and increase the secretion of CRH in the hypothalamus.Conclusion  The extract of Fructus Corni have  significant protecting efficacy in the animal's model with  kidneyyang deficiency．

    【Key words】  extract  of Fructus Corni ( FCE )，kidneyyang deficiency，calmodulin ( CaM )，hypothalamus，corticotrophin releasing factor（CRH）

    山茱萸为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，含有机酸、糅质、环烯醚萜类、氨基酸和维生素等多种有效成分，它为平补阴阳的中药，有补肝益肾、收敛固涩的功效。已有研究报道山茱萸可补肾阳之虚，提高肾阳虚动物生命质量［1］。为进一步探讨其补肾阳之虚药物作用机制，本实验从分子水平上观察了山茱萸提取物（extract of Fructus Corni , FCE）对肾阳虚动物的下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）分泌及钙调蛋白（CaM） mRNA表达的影响。

    1  材料与方法

    1.1  动物  成年健康雄性SD大鼠80只，雌雄各半，体重为220～280 g，由滨州医学院实验动物中心提供。

    1.2  药物  获FCE的方法是乙醇提取后，浓缩，过大孔吸附树脂，收集乙醇洗脱液，减压浓缩得到稠膏，实验时稀释成所需浓度，由本实验室提供。醋酸泼尼松龙注射液，仙居制药有限公司，批号010330，规格125 mg/5 ml。

    1.3  造模、分组及给药  采用经典的以大剂量肾上腺皮质激素造肾阳虚动物模型的方法［2］。将雄性大鼠随机分为5组，每组16只。正常空白对照组每只每日10 ml／kg自来水灌胃，其余4组每只每天上午在臀部皮下注射醋酸泼尼松龙0.5 ml／100 g。与此同时，模型空白对照组（肾阳虚组）每只灌胃给予自来水每日10 ml／kg；山茱萸小、中、大剂量组，每日每只灌胃分别给予10、5、2 g／kg FCE。连续注射醋酸泼尼松龙7 d后，停药6 d。在造模同时，连续灌胃给予自来水或药物13 d。

    1.4  下丘脑取材方法  第13天，用药后2 h，所有动物断头，按文献［3］方法取大鼠下丘脑，放入冻存管，立即置于液氮中固定，然后转入低温冰箱-70℃保存。

    1.5  大鼠下丘脑CRH含量的检测  采用放射免疫法测定。每组取下丘脑组织5个，称重后在生理盐水中煮沸5 min以灭活酶, 减少神经肽蛋白水解酶，加1 ml 1 N乙酸匀浆, 静置1 h, 使活性肽充分溶解；加0.8 ml 1N 氢氧化钠中和,离心,取上清1 ml, - 70℃冷冻保存待测。放射免疫测定用平衡饱和加样程序，加样总反应体积300 μl，4℃孵育24 h后, 每管加分离剂500 μl,混匀后室温放置45 min,4 000r/min离心20 min,弃上清,测定沉淀的放射性核素闪烁计数值,并依照标准曲线换算为pg/mg。

    1.6  实时荧光定量RTPCR检测CaM mRNA的表达

    1.6.1  总RNA的提取:下丘脑组织每组各取5个，用Invitrogen公司TRIZOL试剂盒提取总RNA，按说明书操作。

    1.6.2  引物:从GenBank中查出大鼠CaM基因和大鼠βactin的mRNA序列，利用美国PE公司引物设计软件Primer Express设计基因专一性引物CaM上游引物是5'GATAAGGACGGCAATGGCTACA3'，下游引物是5'CGATGTCTGCTTCCCTGATCAT3'，扩增片段为115 bp。βactin（内参对照）上游引物是5'CCTGTGGCATCCATGAAACTAC3',下游引物是5'CTTCTGCATCCTGTCAGCGAT3', 扩增片段为134 bp。

    1.6.3  RTPCR

    1.6.3.1  cDNA的合成：在50 μl逆转录反应体系中进行反转录（5 μl TaqMan Buffer、1.25 μl Reverse Transcritase（1.25 U/μl）、1 μl  Rnase Inhibitor（0.4 U/μl）、10 μl dNTP mixture、11 μl MgCl2（5.5 mM）、2.5 μl Oligod(T)16（2.5 μM）、5 μl RNA Sample，于25℃孵育10 min，48℃逆转录反应30 min，95℃逆转录灭活5 min。

    1.6.3.2   PCR扩增：取逆转录产物5 μl，加入20 μl扩增反应体系（2.5 μl SYBR PCR Buffer、3 μl MgCl2、2 μl dNTPmixture、0.125 μl AmpliTaq Gold、各0.5 μl上下游引物）中进行PCR反应，94℃ 5 min变性、 55℃ 2 min退火、72℃ 5 min延伸，32个循环。

    1.7  PCR产物分析  根据正常对照组和实验组PCR产物的Ct值,计算每一样品和其内参对照的相对含量。Ct值即Cycle threshold，含义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，Ct值越小样本中的起始拷贝数越高。PCR循环在到达Ct值所在循环数时刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好。

    1.8  统计学分析  数据以x±s表示，采用SPSS11软件进行统计分析，采用t检验进行两两比较，P＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  各组大鼠下丘脑中CRH含量  肾阳虚组CRH含量明显低于正常对照组, 山茱萸小、中剂量组CRH含量较肾阳虚组相比略高一些,但各组之间差异无显著性意义。山茱萸大剂量组CRH含量较肾阳虚组升高,两组之间差异有显著性意义(见表1) 。

    2.2  各组大鼠下丘脑中CaM mRNA的表达情况  通过琼脂糖凝胶电泳图像证明所扩增片断CaM mRNA(115 bp) ,β2actin mRNA(134 bp) 为特异性扩增（见图1）。运用实时荧光定量PCR 技术确定所扩增产物量,为了避免试验过程中操作所带来的误差,以大鼠CaMmRNA 和βactin mRNA 扩增产物量(Ct 值) 的比值来衡量大鼠CaM mRNA 的表达情况。

    下丘脑CaM mRNA 的表达,肾阳虚组CaM mRNA 的表达明显高于正常对照组, 山茱萸小剂量组CaM mRNA 的表达较肾阳虚组相比略低一些,但各组之间差异无显著性意义。山茱萸中、大剂量组CaM mRNA 的表达较肾阳虚组相比降低,两组之间差异亦有显著性意义(见表1) 。表1  各组大鼠下丘脑中CaM mRNA的表达注：与空白对照组相比*P＜0.05 ;与模型空白对照组相比 #P＜0.05

    3  讨论

    肾阳虚动物模型是依据临床肾阳虚患者呈肾上腺皮质功能低下，肾阴虚患者呈肾上腺皮质功能亢进，长期大量需要肾上腺皮质激素治疗的病人表现肾阴虚、皮质激素停用后表现为肾阳虚等研究结果而设计的。目前一般认为，使用大剂量外源性皮质激素于动物体，可致下丘脑垂体肾上腺皮质轴( hypothalamuspituitaryadrenal axis ,HPAA)反馈抑制，因此肾阳虚证具有不同程度的HPAA 功能低下,潜伏着“阴损及阳”的病理机转［4］。当皮质激素突然停用，HPAA的抑制状态即暴露出来。蔡定芳等［1］还发现肾阳虚动物CRH分泌不足，因此肾阳虚定位于下丘脑。CRH是一个由41个氨基酸组成的神经肽，1981年由Vale分离并明确结构, 含有CRH密度最高的细胞胞体位于下丘脑室旁核。CRH 与下丘脑神经细胞内分泌、生理机能、神经化学和行为反应密切相关，本实验采用大剂量氢化考的松建立肾阳虚动物模型，肾阳虚组CRH含量明显低于正常对照组,表明造模成功。山茱萸大剂量组CRH含量较肾阳虚组明显升高。

    钙调蛋白（CaM）是一种多功能的Ca2+受体蛋白，它通过与Ca2+结合形成复合物而介导Ca2+与许多功能蛋白和结构蛋白的相互作用，进而参与各种细胞功能的调控［6］。CaM在HPAA中的含量相对较高，并参与HPAA的调控，与其功能密切相关［7，8］。有研究已证明肾阳虚大鼠下丘脑中CaM、血清钙显著升高，因此可通过衡量CaM在HPAA中的含量来观察HPAA的功能［9］。本实验观察到，肾阳虚组大鼠下丘脑CaM mRNA的表达量明显高于空白对照组。山茱萸水提取物（FCE）可降低肾阳虚大鼠下丘脑CaM mRNA 的表达量, 其中大、中剂量山茱萸组CaM mRNA 和βactin mRNA 扩增产物量(Ct 值) 的比值分别为1.194 ±0.029、1.064 ±0.029，明显低于肾阳虚组（1.327 ±0.043）。提示该药通过调整大鼠下丘脑CaM mRNA 的表达量，提高了肾阳虚大鼠的存活率和生命质量，对阴损及阳的肾阳虚证，有较显著的补益肾阳功效。据此结果推知，可以认为肾阳虚动物HPAA 受抑制可能是大量糖皮质激素对下丘脑CaM mRNA 的诱导,形成过量Ca2+·CaM复合物,从而抑制激素释放,使HPAA 紊乱,出现肾阳虚。FCE补肾阳作用，不是激素替代治疗，本实验表明FCE可提高肾阳虚动物下丘脑CRH分泌量，调整HPAA轴的功能紊乱，其机制可能是通过抑制下丘脑 CaM mRNA 表达,使Ca2+·CaM 复合物减少,激素释放逐步恢复正常。而这一过程是十分复杂的,有待进一步的研究证实。

    山茱萸是近年来中医药临床研究证明能够治疗糖尿病、冠心病、高血压病的主要药材之一，因此越来越受到人们重视。我们从分子水平上观察到山茱萸提取物（FCE）对肾阳虚动物的下丘脑CRH分泌的影响，此研究结果将有助于促进山茱萸深层次开发利用。

【参考文献】
  ［１］ 许鸿章，李电东，孙丕，等.茱萸水溶性总提取物对肾阳虚动物模型生命质量和肾上腺组织的影响［J］.中医杂志,2001,42(8):491493.

［2］ 陈奇.中药药理研究方法学［M］．北京：人民卫生出版社，2006：10941100．

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［4］　郑海生,蒋健,贾伟.中医学肾阳虚证的现代研究概述［J］.辽宁中医杂志，2007，34（7）：10141016.

［5］　蔡定芳,沈时谋,陈晓红,等. 仙灵脾减轻外源性糖皮质激素抑制神经内分泌免疫作用的临床与实验研究［J］.中国中西医结合杂志,1998,18(1):47.

［6］　Gannon MN ,McEwen BS. Distribution and regulation of calmodulin mRNA in rat brain［J］ . Mol Brain Res,1994,22:186192.

［7］　宋春风. 钙调素对下丘脑垂体靶腺轴功能的影响［J］. 国外医学内分泌学分册1999，19 (2):4950.

［8］ 蒋淑君，王桂兰，许兰芝.糖皮质激素对HPAA的影响及仙灵脾的调整作用［J］.滨州医学院学报，2004，27（2）：8790.

［9］　宋春风,郑师陵,吕佩源,等. 补肾中药对肾阳虚大鼠下丘脑垂体肾上腺轴和血清钙的影响［Ｊ］.中国中西医基础医学杂志,2002,8(5):3436.

作者单位：滨州医学院生理学教研室 滨州市 256603；滨州医学院附属医院内科