针刺对吗啡戒断大鼠情绪及氨基酸水平的影响

【摘要】  目的 探讨针刺对吗啡戒断大鼠情绪的作用及对蓝斑（locus ceruleus，LC)氨基酸水平的影响。方法 采用剂量递增方法，皮下注射吗啡形成大鼠依赖后，给予纳洛酮催促，建立吗啡戒断后焦虑模型。采用“神门穴”针刺治疗和十字迷宫行为学测试的方法，观察针刺对吗啡戒断后大鼠的焦虑情绪的作用；采用高效液相色谱电化学检测法测定甘氨酸(glycine, Gly)、谷氨酸(glutamate,Glu)和γ氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA)含量。结果 ①针刺可使吗啡戒断后焦虑模型大鼠在开臂滞留时间百分比增大(P＜0.01)， 探究行为增多(P＜0.01)。②戒断大鼠蓝斑Gly、GABA含量降低，Glu含量升高(P＜0.05)；针刺使戒断大鼠蓝斑Gly、Glu含量增高，Glu含量降低(P＜0.05)。 结论 针刺对吗啡戒断后大鼠的抗焦虑效应可能与针刺调节焦虑模型大鼠脑内Gly、GABA、Glu的释放有关。

【关键词】  吗啡戒断 焦虑 甘氨酸 谷氨酸 γ氨基丁酸 针刺

    Effect of acupuncture on emotion and level of amino acids  after morphine withdrawal

    WANG Guihua  PAN Hong  Wang Min  et al

    Department of Physiology, Binzhou Medical University, Binzhou  256603

    【Abstract】  Objective  To observe the impact of acupuncture on the anxiety and level of amino acids within locus ceruleus (LC) in morphine withdrawal rats.Methods  Morphine addictive model was constructed by doseincreasing administration. And the rats were given naloxone to establish anxiety model of morphine withdrawal. To observe the effect of acupuncture on “shenmen point” on withdrawal rats' anxiety. The elevated plusmaze test was used to assess the rat' s anxiety. High performance liquid chromatographymasss pectrometry( HPLCMS) was used to quantify the Gly and GABA，Glu in LC. Results  ①The OT% in open arms went up and exploring behavior increased on withdrawal rats' anxiety after acupuncture(P＜0.01).  ②Quantity of Gly and GABA within LC decreased and Glu increased in morphine withdrawal rats(P＜0.05). level of Gly，GABA increased and Glu decreased after acupuncture on withdrawal rats(P＜0.05).Conclusion  The  effect of acupuncture antianxiety applied on the morphine withdrawal rats was possibly related to the release of Gly，GABA，Glu by acupuncture in brain of anxiety rat's.

    【Key words】  morphine withdrawal，anxiety，glycine，glutamate，GABA，acupuncture

    吗啡依赖是一种慢性复发性脑病，主要表现为对成瘾性药物的强迫性用药行为及用药量的不可控制性。其中焦虑是阿片类毒品依赖者重要的戒断症状和稽延症状,觅药行为及复吸与焦虑成正相关。已有针灸临床资料表明,针刺对吗啡戒断后的焦虑有良好的改善作用［1］ ，但其作用机制研究尚少见报道。为此,我们采用吗啡依赖戒断后焦虑模型,观察了氨基酸在针刺抗吗啡戒断后焦虑大鼠模型中的作用,为初步揭示针刺抗吗啡戒断后焦虑的作用机制提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物和药物：健康SD大鼠（第三军医大学动物实验中心提供）18只，雌雄不拘，体重180～220 g，常规饲养。盐酸吗啡注射液由沈阳制药厂提供，盐酸纳洛酮注射液由益桥(湖南) 制药有限公司提供，γ氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，色谱甲醇和色谱乙腈由天津康科德科技公司提供。

    1.1.2  仪器与设备：高架十字迷宫自动跟踪系统（四川成都泰盟科技有限公司），LH402型韩式穴位神经刺激仪（北京力普康医药科技发展公司），高效液相色谱系统(日本岛津公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  实验分组及处理方法：大鼠18只,按照随机分组原则分为3组，分别为：对照组（6只）、戒断组（6只）、戒断组加针刺组(简称针刺组，6只)。对照组：除每天在相同的时间进行与其他组相同的方法注射生理盐水和固定外，不做任何处理；戒断组：皮下注射吗啡，首日10 mg/kg注射2次，隔日每次增加10 mg／kg，至第6日末次注射50 mg/kg，建立吗啡依赖性模型。吗啡依赖大鼠于末次注射吗啡后4 h，腹腔注射纳洛酮4 mg／kg，可激发戒断症状为吗啡戒断组。随后6 d只进行与针刺组相同的固定和迷宫实验。针刺组：在戒断模型基础上,进行针刺治疗;针刺从催瘾后当天开始进行。取“神门”穴。穴位根据《中国兽医针灸学》及《实验针灸学》并结合人体进行参照定位。取穴定位之后连接LH402型韩式穴位神经刺激仪行针刺，波宽0.3 mm sec；频率2/100 Hz；强度以1～2～3 mA递增，每一强度刺激10 min，共30 min。每日治疗1 次,连续6 d［2］。同时进行高架十字迷宫实验。

    1.2.2  样品的处理及测定：戒断组于停药6 d、针刺组于针刺6 d后和对照组分别对其取材。采用断头法处死大鼠(时间限定于18：00—20：00之间，以减少时间节律的影响)，迅速剥开颅骨，参考大鼠脑立体定位图谱。 在人工脑脊液中分离出待测脑区，将同组两只大鼠左右半脑的各脑区样品分别交叉合并，称重后置于-70℃下保存备氨基酸检测使用。

    氨基酸标准溶液的配制：精密称取 Gly、Glu和GABA标准品，用人工脑脊液配制成1 g/L的标准储备液，-70℃冻存。临用前用人工脑脊液配制成10.24、25.6、 64.0、160、400、1 000 μg/L。样品中氨基酸的提取:脑组织样品加入0.5 ml冰冷的人工脑脊液，冰浴下电动匀浆1 min，匀浆液低温12 000r/min,离心20 min，取出上清液，用两倍体积的甲醇沉淀蛋白，上清于-40 ℃冰冻保存，于检测前用蒸馏水稀释至适宜浓度后备测。

    样品中氨基酸的检测:参照文献［3］方法，调整后采用柱前、邻苯二甲醛(Ophthaldialdehyde, OPA )衍生化电化学检测高效液相色谱法，以香草醛为内标测定Gly、Glu和GABA的含量。色谱条件:保护柱:C18,5 μm,3 cm，Diamonsil钻石C18,反相色谱柱(5μm, 4.6 mm ×150 mm ID)，流动相为醋酸钠柠檬酸缓冲液(0.05 mol/L)甲醇EDTA (0.01 mol/L)三乙胺(78∶21∶1∶0.2)，使用前经0.45 μm有机相微孔滤膜负压滤过，并超声脱气15 min。流速1.2 ml/min，柱温40 ℃。电化学检测器:玻碳工作电极，Ag/AgCl参比电极，工作电压+0.8 V。

    1.2.3  统计学处理  数据以均数±标准差(x±s) 表示, 采用SPSS10.0 统计软件包进行单因素方差分析,统计结果以P＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  十字迷宫行为观察结果  戒断大鼠在开臂内表现出更多的焦虑相关行为，如自由活动减少、僵住不动、排便等。产生恐惧焦虑情绪的大鼠在开臂停留时间百分比（open time percent,OT%)、进入开放臂次数百分比（open enter percent,OE%)及探头次数明显减少，与对照组存在着显著差异。结果详见表 1～3。表1  纳洛酮催瘾后各组动物在开臂滞留时间、进入次数的百分比及探头次数比较(x±s)组别nOT％  OE％  探头次数  对照组629.5±6.2 31.9±5.511.6±2.6   戒断组68.9±3.5△12.1±2.6△5.0±1.8△   针刺组69.4±4.7△14.9±3.8△5.1±1.4△  注：与对照组比较 △P＜0.05 表2  针剌3 d后各组动物在开臂滞留时间、进入次数的百分比及探头次数比较注：与对照组比较△P＜0.05，与戒断组比较  *P＜0.05表3  针剌6 d后各组动物在开臂滞留时间、进入次数的百分比及探头次数比较注：与对照组比较 △P＜0.01，与戒断组比较  *P＜0.01

    从表1得知,纳洛酮催瘾后,戒断组和针刺组大鼠在开臂停留时间和进入次数的百分比及探头次数低于对照组 (P＜0.05) ,表明焦虑模型成功。由表2可知，接受针刺治疗3 d后, 针刺组大鼠在开臂停留时间和进入次数的百分比高于戒断组(P＜0.05)，但仍低于对照组(P＜0.05)，提示针刺具有抗焦虑的治疗效应。从表3得知,在接受治疗6 d后,针刺组大鼠在开臂停留时间和进入次数的百分比及探头次数高于戒断组(P＜0.05) ，与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。提示针刺抗焦虑的治疗效应,随着治疗时间的增加而继续维持。

    2.2  针刺后戒断大鼠蓝斑氨基酸水平的变化  结果见表4 。表4  针刺后吗啡戒断大鼠蓝斑氨基酸水平的变化注：与对照组比较 *P＜0.05，△P＜0.01，与戒断组比较#P＜0.05

    由表4可知，吗啡戒断使大鼠蓝斑GABA水平下降，Gly水平也有所下降，与对照组比较有统计学意义（P＜0.05），而Glu水平显著升高明显高于对照组 (P＜0.01)；针刺治疗后大鼠蓝斑GABA、Gly较戒断大鼠水平升高（P＜0.05），而Glu水平与戒断大鼠比较有所降低（P＜0.05）。

    3  讨论

    高架十字迷宫模型为国际公认和常用的一种大鼠焦虑模型，它以动物自发行为为基础，动物不需要特殊训练,利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理,形成动物的矛盾行为,以动物滞留开臂和闭臂的时间长短来反应动物的焦虑状态,具有与临床更为接近的优势。本实验以逐日递增法形成吗啡依赖大鼠模型,腹腔注射纳洛酮催促戒断后,采用高架十字迷宫筛选焦虑模型大鼠。迷宫实验结果表明,吗啡戒断后大鼠滞留在闭臂的时间长于对照组与针刺组(P＜0.05) ,说明吗啡戒断后大鼠已呈现出焦虑状态, 提示本实验造模成功。实验中,观察到戒断组大鼠在迷宫开臂滞留时间短于针刺组大鼠, 在闭臂滞留时间则长于针刺组大鼠，说明电针具有抗吗啡戒断后焦虑的治疗效应。

    目前学术界已公认，吗啡、海洛因戒断后焦虑情绪的产生,与中枢多种神经系统功能异常变化有关。吗啡依赖形成过程涉及复杂的神经生物学机制。传统观点认为，多巴胺受体系统、阿片受体系统、氨基酸递质系统是介导阿片类物质依赖和戒断的主要中枢递质系统［4］。吗啡依赖是吗啡长期使用后导致的一种神经及行为可塑性方面的变化，而谷氨酸能系统在神经可塑性中具有重要的作用。本实验中纳洛酮催促戒断时大鼠蓝斑中Glu水平升高，与文献报道一致［5］。表明戒断时蓝斑处于兴奋状态，这种兴奋状态可能在吗啡戒断焦虑反应中发挥重要作用。谷氨酸系统参与吗啡戒断反应，谷氨酸受体拮抗剂MK801等可以减弱纳洛酮催促的吗啡依赖大鼠的戒断症状也证明了这一点。本试验发现戒断使大鼠蓝斑中GABA水平显著下降，GLY水平也有所下降。GABA和Gly为哺乳动物中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质，其水平在蓝斑中的降低，表明蓝斑处于去抑制状态。行为学实验戒断大鼠表现出明显的焦虑状态。

    杨爱霞等［6］认为毒浊之气侵肺，肺卫之气侵入胃肠，胃肠郁闭，腑气不通，胃失和降，脾失运化，生化无权，精血渐耗，先天之本失养，三焦郁闭，心神被扰，清窍蒙敝。治宜通泻六腑，荡涤毒浊，宁神醒窍。针灸戒毒旨在调节吸毒者体内阴阳平衡及脏腑的偏盛偏衰,使之恢复正常。据中医取穴特点分析焦虑伴心悸取神门； 烦躁失眠神门、三阴交、内关、水沟、安眠、印堂、大椎、十宣［7］。本实验结果表明,神门穴具有抗吗啡戒断后焦虑的治疗效应。

    给予戒断大鼠针刺治疗后蓝斑中GABA、Gly水平升高，而Glu水平降低，同时行为学实验发现大鼠的各项焦虑指标明显降低。提示中枢氨基酸水平可能参与戒断反应及焦虑症状的产生。戒断大鼠针刺后脑内氨基酸水平发生改变，戒断大鼠的焦虑症状明显改善。说明针刺不仅能够对抗吗啡戒断后焦虑,从行为学方面产生治疗效应,还可能调节中枢氨基酸水平的变化，起到抗焦虑作用。现有资料表明中枢内氨基酸水平的变化是导致吗啡戒断后焦虑的关键。焦虑与阿片系统、5HT、Ach、NE、GABA递质的功能紊乱有着极为密切的关系［8］。而氨基酸系统对其他系统起一定的上调及下调作用，但这一作用机制及与其他神经递质之间的关系如何,还有待于进一步研究。

【参考文献】
  ［１］ 王晓中.中西医结合防治药物依赖［M］. 北京:中国医药科技出版社，2001：698761.

［2］ 李莎莎,康林,吴滨，等.电针对吗啡依赖大鼠条件性位置偏爱效应的作用研究［J］.四川大学学报（医学版）,2004,35(6):824827.

［3］ 刘建芳，侯艳宁，刘会臣.柱前衍生电化学检测HPLC测定大鼠脑内的谷氨酸和γ氨基丁酸［J］.解放军药学学报，2000,16(6):299302.

［4］ De Vries TJ,Shippenberg TS.Neural systems underlying opiate addiction［J］. J Neurosci,2002,22(9):33213325.

［5］ Tokuyama S, Zhu H, Wakabayashi H，et al. The role of glutamate in the locus coeruleus during opioid withdrawal and effects of H7,a protein kinase inhibitor,on the action of glutamate in rats［J］.J Biomed Sci,1998,5(1): 4553.

［6］ 杨爱霞，刘东亮，杨赟.中医药在毒品成瘾分期治疗中的应用体会［J］.甘肃中医，1999，12（3）：1213.

［7］ 杨桦，高玉杰，杨丽美.针灸戒毒取穴的特点分析［J］.时珍国医国药，2006,17（10）：2053.

［8］ Desouza H. Intranasal administration of the dopaminergic agonists LDOPA,amphetamine,and cocaine increases dopamine activity in the necutranum's microlialysis study in the rat［J］.Neurochemistry，2006,68:233239.

作者单位：滨州医学院生理学教研室 滨州市 256603