小叶女贞对免疫功能损伤小鼠T淋巴细胞免疫功能的调节作用

【摘要】  研究小叶女贞对免疫功能损伤小鼠T淋巴细胞免疫功能的调节作用。方法 以免疫功能损伤小鼠为研究对象，将实验鼠随机分为5组，每组12只，分别为生理盐水（NS）对照组、环磷酰胺（Cy）对照组、Cy+小叶女贞水煎液（小剂量）组、Cy+小叶女贞水煎液（大剂量）组、Cy+女贞子水煎液组。利用流式细胞仪检测实验鼠外周血T淋巴细胞（CD4+、CD8+）的百分率，计算CD4+/ CD8+比值，用全自动酶标仪检测外周血IL2的含量。结果 小叶女贞小剂量组和大剂量组CD4+T细胞、CD4+/ CD8+、IL2的含量分别与环磷酰胺组比较均明显增高，有显著性差异（P＜0.01）；与生理盐水对照组比较，小剂量组无显著性差异（P＞0.05）、大剂量组明显增高，有显著性差异（P＜0.01）；与女贞子对照组比较，小剂量组结果低，有显著性差异（P＜0.01）、大剂量组无显著性差异（P＞0.05）。结论 小叶女贞能使小鼠受损伤的免疫功能得到改善, 能提高CD4+T细胞的数量和IL2含量，对免疫功能的调节作用与剂量成正相关。小叶女贞对T淋巴细胞免疫功能的调节机制是促进T淋巴细胞分化、发育为成熟的CD4+T细胞，达到调节机体细胞免疫功能的作用。

【关键词】  小叶女贞 小鼠 免疫功能损伤 T淋巴细胞免疫功能 调节作用

 A Modulation effect of ligustrum quihoui carr (LQC)on the immune

    function of T  lymphocytes in mouse with impaired immune function

    HAN Zhaodong  RUAN Yueqin  SONG Yueyan  et al

    Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603

    【Abstract】  Objective  To explore the modulation effect and mechanism of  ligustrum quihoui carr(LQC) on the immune function of T lymphocytes in mouse whose immune function was damaged.Methods  Mice with impaired immune function were experimental animal ,and divided into five groups randomly,twelve mice in every group,the decoction of LQC acted as experimental sample ,using the Cyclophosphamide and 0.9% NaCl as the positive comparison sample and negative comparison sample respectively, LQC minor dose,major dose,and fructus ligustri lucidi,adding Cyclophosphamide respectively,The percentage of T lymphocytes（CD4+、CD8+） in the peripheral blood of the experimental mice was detected by flow cytometer , then calculated the ratio of CD4+  to CD8+,the content of IL2 in the peripheral blood is examined by Denley.Results  Contrast minor dose group and major dose group with Cyclophosphamide group respectively , the result was that the content of CD4+T cell CD4+/CD8+ IL2 all improved dramatically ,with significant difference (P＜0.01).When drawing a parallel between 0.9% NaCl and minor dose group ,there was no significant difference (P＞0.05).But when compared with the major dose group,there was significant difference between them(P＜0.01). Compared with fructus ligustri lucidi , in the minor dose group ,the curative effect was worse ,there was significant difference (P＜0.01). But in major dose group ,there was no significant difference between them (P＞0.05). Conclusion  The immune function of the damaged mice were improved by LQC,which  also could increase the quantity of CD4+T cell and the content of IL2. The dose of  LQC was positively correlated with the modulation effect of LQC on the immune function.The mechanism of regulation of LQC on the immune function of T lymphocytes  could be realized by promoting the differentiation of T lymphocytes and developing to be mature CD4+ T cells ,so that it can regulate the cell immune function of body.

    【Key words】  ligustrum quihoui carr ( LQC)，mouse，impaired immune function，immune function of T lymphocytes，modulation effect

    小叶女贞又叫小白蜡，为木犀科女贞属植物小叶女贞（ligustrum quihoui carr，LQC)  的果实［1］，性凉、味苦，和女贞子属于同科同属植物。初步研究［2，3］表明，小叶女贞可使ConA激发的T淋巴细胞增殖反应明显增强,对细胞因子IL2有促进作用，能促进IL1的分泌，调节骨髓造血功能。但小叶女贞对免疫功能损伤动物的免疫调节作用未见报道。我们以免疫功能损伤小鼠为研究对象，以小叶女贞的水煎液为实验样品，以女贞子的水煎液和生理盐水为阳性对照品和阴性对照品，利用流式细胞仪检测实验小鼠外周血T淋巴细胞（CD4+、CD8+）的百分率，计算CD4+/ CD8+比值，用全自动酶标仪检测IL2的含量。研究在病理状态下，小叶女贞对小鼠T淋巴细胞免疫功能的调节作用及机制，为进一步开发、利用小叶女贞提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1. 1  药品和试剂：小叶女贞和女贞子（由滨州医学院附属医院中药房提供），环磷酰胺（购于滨州医学院附属医院西药房）。Rat荧光单克隆抗体CD3PC5，CD4PE，CD8FITC；同型对照IgG2aPE、IgG2aFITC购于美国CALTAG Laboratories公司。全血溶血试剂购自美国Coulter公司。IL2试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司。

    1.1.2  动物：健康BALB/C小鼠60只，体重18～22 g，雌雄不限，购于北京医科大学实验动物中心。

    1.1.3  仪器：FC500大型流式细胞仪、QPREP溶血制备仪均为美国贝克曼库尔特公司生产，Denley全自动酶标仪。

    1.2  方法

    1.2.1  样品制备：取小叶女贞或女贞子400 g，加蒸馏水2 500 ml浸泡2 h,水煎，煮沸30 min,过滤，药渣加水1 000 ml，二次水煎，取滤液（压渣），合并水煎液，浓缩成400 ml，即为样品水煎液。

    1.2.2  动物分组：将小鼠随机分为5组，每组12只。Ⅰ组为生理盐水（NS）对照组，NS 0.2 ml/d,  皮下注射，共10 d，第8日起用NS灌胃，0.2 ml/（d·只），共7 d。Ⅱ组环磷酰胺（Cy）对照组，Cy 0.8 ml/d，皮下注射［20 mg/（kg·d）］，共10 d，第8日起用NS灌胃同Ⅰ组。 Ⅲ组为Cy+小叶女贞水煎液组（小剂量），注射Cy同Ⅱ组，第8日起胃饲小叶女贞水煎液0.2 ml/（d·只），共7 d。Ⅳ组为Cy+小叶女贞水煎液（大剂量）组，注射Cy同Ⅱ组，第8日起胃饲小叶女贞水煎液0.4 ml/（d·只），共7 d。Ⅴ组为Cy+女贞子水煎液组，注射Cy同Ⅱ组，第8日起胃饲女贞子水煎液0.2 ml/（d·只），共7 d。

    1.2.3  标本采集及处理：所有受试小鼠均摘取眼球取外周血，分别置于含EDTAK2防凝管和小塑料管中，室温保存，在12 h内检测分析。

    1.2.4  流式细胞仪分析：①首先用Flowcheck进行光路和流路校准，使所有荧光信号CV﹤2%。②在标有同型对照的试管中分别加入CD3PC5单克隆抗体和IgG2aFITC和IgG2aPE同型对照试剂各5  μl,再加入正常小鼠K2EDTA防凝血100 μl（5×105 cells）混匀，室温避光15　min后，在标本制备仪上溶血、固定上机。以前向散射光（FSC）及侧向散射光（SSC）设门（A）于淋巴细胞群（图1），以CD3PC5及SSC设门（H）于CD3+细胞(图2)，调节电压使同型对照细胞位于阴性区（图3、4）。③在标有CD4、CD8的试管中分别加入CD3PC5和CD4PE及CD8FITC单克隆抗体各5 μl，分别加入各实验小鼠K2EDTA防凝血100 μl（5×105 cells）混匀，室温避光15 min后，在标本制备仪上溶血、固定上机，调节颜色补偿，分析各组每一实验小鼠CD4+、CD8+细胞的百分率。计算CD4+/CD8+比值。

    1.2.5  IL2的测定：严格按试剂盒说明书进行操作，全自动酶标仪定量测定小鼠外周血IL2含量。

    2  结果

    2.1  实验各组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+ 、IL2测定结果见表1。 表1  小叶女贞对免疫功能损伤小鼠T淋巴细胞和IL2的作用  注：*示分别与环磷酰胺组、高剂量组、女贞子组比较，P＜0.01；与盐水对照组比较，P＞0.05。

    #示分别与环磷酰胺组、低剂量组、盐水对照组比较，P＜0.01；与女贞子组比较，P＞0.05。

    各组指标检测结果经统计学处理，CD4+T细胞数、CD4+/ CD8+比值、IL2的五组均数方差分析分别为F=23.6、F=19.8、F=40.6，P均＜0.01，有统计学意义。

    2.2  流式细胞仪检测实验鼠CD4+、CD8+结果  小叶女贞小剂量组（图5），小叶女贞大剂量组（图6）。

    图5

    图6

    3  讨论

    本实验以免疫功能损伤小鼠为研究对象，以小叶女贞的水煎液为实验样品，以女贞子的水煎液和生理盐水为阳性对照品和阴性对照品，研究了小叶女贞对免疫功能损伤小鼠T淋巴细胞的调节作用和机制。研究结果显示，小叶女贞水煎液能提高免疫功能损伤小鼠CD4+T细胞的数量和IL2含量，说明小叶女贞能使受损伤动物的免疫功能得到改善,并提高机体的细胞免疫功能。小叶女贞低剂量组能将受损伤小鼠的免疫功能调节至与盐水对照组相近的水平,对免疫功能的调节作用与剂量成正相关。小叶女贞与女贞子对照组比较，有相同的免疫调节作用。由于CD4+或CD8+T细胞是在胸腺内发育、分化形成的成熟T淋巴细胞，T细胞的发育过程更倾向于形成CD4+T细胞，在胸腺中以及在外周血的CD4+是CD8+T细胞的1～2倍，是T淋巴细胞免疫功能的重要标志。IL2是T淋巴细胞从细胞周期G1期到S期生长有关的主要细胞因子，是T细胞主要的自分泌生长因子［4，5］。因此，小叶女贞对T淋巴细胞的调节机制可能是促进CD4+T淋巴细胞的分化、发育、成熟。达到调节提高机体细胞免疫功能的作用,这在治疗动物免疫性疾病方面有广泛的应用前景，并为进一步研究、开发、利用小叶女贞提供了理论依据。

【参考文献】
  ［1］ 全国中草药汇编组.全国中草药汇编（下册）［M］.北京：人民卫生出版社，1983：75.

［2］ 孙丰润，邱世翠，张循格，等.小叶女贞对小鼠淋巴细胞和IL2产生的影响［J］.滨州医学院报，2003，26（1）：2～4.

［3］ 邱世翠，孙丰润，韩兆东，等.小叶女贞对小鼠骨髓细胞增殖和IL1的影响［J］.中国中医药科技，2003，10（4）：230.

［4］ 邹雄,张利宁.分子免疫学与临床［M］.济南：山东科学技术出版社，2003：155.

［5］ 龚非力.医学免疫学［M］.北京：科学出版社，2004：144.

作者单位：滨州医学院附属医院中心实验室 滨州市 256603