大鼠胰腺发育中肝细胞因子受体编码基因的

【摘要】  目的 研究肝细胞因子受体编码基因cmet在大鼠胰腺发育不同阶段的表达及其编码蛋白的细胞定位。方法 采用RTPCR技术检测cmet基因在大鼠胰腺不同发育时期：孕15.5 d（E15.5）和孕18.5 d(E18.5)、生后14 d(P14)、生后21 d（P21)、新生及成年胰腺的表达；并用免疫组化技术检测该基因编码的蛋白cMET在胰腺发育不同阶段的细胞定位。结果 cmet基因在E15.5、E18.5 d较成年特异性高表达，免疫组化结果显示该基因编码的蛋白cMET在新生后的胰腺大量定位于胰岛细胞。结论 cmet可能在胰腺发育过程中起到调控作用，参与胰腺发育中新生后胰岛结构重塑过程。

【关键词】  cmet；胰腺生长发育；RTPCR；免疫组化

    Expression and protein location of cmet in the different stages of rat pancreatic development

    CHENG Mei1  WU Yulong2

    1 Department of Medical Nursing,Binzhou Medical University，Binzhou 256603；2 Pepartment of Etiology,Binzhou Medical University

    【Abstract】  Objective  To investigate the expression and location of  cmet  protooncogene   in the different development stages of rat pancreas.Methods  Using RTPCR to detect the expression of cmet protooncogene in different development stages of rat pancreas:embryonic day 15.5，embryonic day 18.5，postnatal day 14，postnatal day 21，newborn and adult pancreas. Using  immunohistoche  to  detect the location of the protein of cmet protooncogene in the different stages of rat  pancreatic development.Results   cmet protooncogene expresses highly at rat postnatal days, espacially at P14、P21of rat pancreatic development stages .Conclusion  cmet protooncogene may play a role in the development of rat pancreas espaciallyin the islet remodation of postnatal rat pancreatic development.

    【Key words】  cmet protooncogene，pancreatic development，RTPCR

    近年来，原癌基因cmet受到越来越广泛重视。其编码蛋白的不同亚型异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关［1～3］。自Lobstein 和Recamier 提出肿瘤的胚胎性源性概念以来,胚胎细胞与恶性肿瘤细胞生物学的比较研究日益受到了人们关注［4］，肿瘤细胞的发生、发展和胚胎发育过程存在一定的相似性［5～7］。在人类该基因全长为6 641 bp,存在不同转录本，大鼠该基因全长4 189bp,编码形成的cMET蛋白与人类的cMET蛋白具有高度的同源性。2004年Atsushi等用流式细胞仪在成年小鼠胰腺导管上皮细胞检测到cMET蛋白的表达［8］。而该蛋白在胰腺发育不同阶段的表达及定位，未见明确报道。

    本研究以SD大鼠为模型，选取孕15.5 d（E15.5）、孕18.5 d（E18.5）及新生、生后14 d(P14)、生后21 d(P21)及成年这几个大鼠胰腺发育和功能完善的关键时期，通过RTPCR技术对cmet原癌基因在胰腺发育不同阶段的表达做出初步分析，并用免疫组化技术对该基因所编码的蛋白在大鼠胰腺不同发育阶段的表达进行定位分析，为揭示cmet基因在胰腺发育细胞功能完善过程中的作用提供了一定依据，为临床糖尿病的治疗新途径提供一定的理论数据。

    1  材料与方法

    1.1  材料  成年SD大鼠60只，雌20只，雄40只，体质量250 g左右，由滨州医学院动物中心提供。mastercycler PCR 仪（Eppendorf公司）,Trizol Reagent(美国Gibco公司) , RNAeasy Mini Kit (Qiagen) , RTPCR试剂盒(Tayobo)，羊抗鼠单克隆抗体（美国Santa cruz公司），兔抗羊二抗（福建迈新公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  组织取材：于6：00 PM时，将雌雄大鼠以1∶2合笼，次日检测有阴栓者，定为受精0.5 d(E0.5) ，取E12.5，E15.5和E18.5胚胎胰腺以及新生鼠胰腺；取怀有胚胎E15.5和E18.5的母鼠，引颈椎脱臼处死，分离出胚胎，显微解剖镜下用显微镊子取出胰腺后，迅速在液氮中冷冻。新生、P14、P21和成年鼠直接分离出胰腺［9］ 。

    1.2.2  RTPCR扩增：根据基因文库cmet的序列，用Primer 5.0 设计PCR扩增引物。上游引物: 5′CCACCCCAATGTTCTCTAC3′,下游引物: 5′GGTGGTGAACTTTTGCGTCT3′，预计扩增产物514 bp；引物由江苏赛百盛基因有限公司合成。 取1 μg的E15.5、 E18.5、新生、P14、P21和成年六个时期（每组5只）胰腺组织总RNA进行反转录：反应条件为 30℃ 10 min，42℃ 20 min， 99℃ 5 min， 4℃ 5   min，合成cDNA。cmet的PCR条件：引物：94℃ 5 min； 94℃ 30 s， 59.5℃ 30 s， 74℃ 1 min， 33个循环。

    RTPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后在紫外光下进行观察照相。用捷达801系列凝胶分析软件进行凝胶密度扫描分析，计算待测基因PCR 产物各条带密度与内对照18sRNA 条带密度, 两者的比值作为待测基因 mRNA表达的相对含量。同一条带重复测量3次。

    1.2.3  免疫组化： 大鼠胰腺发育不同阶段标本均石蜡包埋,切片,常规脱蜡去水。3%H2O2 去离子水孵育5～10 min ,蒸馏水冲洗, PBS 浸泡5 min。滴加封闭用正常山羊血清工作液,室温孵育10 min。滴加1 ∶100 稀释的一抗( 单克隆抗体购自Santa cruz公司) ,37℃孵育1 h , PBS 冲洗3 次。滴加二抗(二抗购自福建迈新公司) ,37℃孵育20 min 。PBS 冲洗3 次,显色剂显色(DAB) 。自来水充分冲洗后,选择封片剂封片。

    2  结果

    2.1  RTPCR结果  用RTPCR技术检测cmet原癌基因在大鼠胰腺发育E15.5、E18.5、新生、P14、P21及成年阶段的表达，结果如图1，经灰度值扫描分析得知该基因在大鼠胰腺胚胎发育期的表达量明显高于成年阶段。

    2．2  免疫组化结果  用免疫组化技术检测cmet原癌基因所编码的蛋白在大鼠胰腺发育E15.5、E18.5新生、P14、P21及成年阶段的表达定位，如图2，结果显示在大鼠胰腺新生、P14、P21这三个阶段cmet原癌基因所编码的蛋白大量定位于胰岛细胞。

    3  讨论

    胰腺发育是一个复杂的过程，胰岛结构的形成和生物学功能发挥是一个重要环节。目前，虽然对胰腺胚胎发育的研究在形态学上已明确，但在分子网络调控机制上却尚不明确［１０］。功能学研究已经证实在胰腺的整个发育过程中信号通路和转录因子起着非常重要的作用，如FGF, Hedgehog, Notch，TGFβ /activin等信号通路以及HNF1 α(Tcf1α ),HNF1 β(Tcf1β ), HNF4α (Tcf4α ), Pdx1, NeuroD1,Ngn3, Pax4, Pax6等转录因子［10,11］。

    原癌基因cmet编码肝细胞生长因子受体cMET，该受体是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的受体，属于酪氨酸激酶src家族。受体与配体结合后导致受体上的酪氨酸磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基能与含SH2功能区的胞内信号转导蛋白结合，激活细胞内多个信号导联，从而产生多种效应：促有丝分裂，调节细胞生长，对组织器官的发育产生影响［12～14］。

    我们前期实验室所作多居寡核苷酸芯片检测结果显示，cmet转录调控基因在大鼠胰腺发育过程中的表达趋势与cmet高度相似。cmet受体信号系统的激活首先是cmet上酪氨酸蛋白激酶（PTK）激活，激活的PTK先使受体自身酪氨酸磷酸化，同时受体自身酪氨酸磷酸化后进一步激活PTK, PTK 再激活靶蛋白上的酪氨酸磷酸化，经过瀑布式的磷酸化反应，将外界信号逐级放大，最终传至细胞核内，导致细胞增殖、分化。其信号传导通路发挥作用有组织器官特异性。芯片结果显示在大鼠胚胎胰腺的发育过程中，cmet信号传导主要是经过MAPK和stat通路。而MAPK的激活包括依赖ras和非ras依赖，芯片中并没有检测到ras的存在，故cmet胰腺中激活，可能是非ras途径，通过PKC激活MAPK［12，13］。信号系统激活后引起细胞核内一系列转录因子cfos、Akt的表达，控制细胞生长及DNA合成，细胞周期素A、B、D和E等的含量也发生变化，最终细胞进入增殖期［15］。

    此次实验检测到cmet的mRNE表达水平在大鼠胰腺胚胎阶段表达量较高，而继胚胎发育期之后的新生后发育阶段检测到cMET蛋白表达量较高，这进一步提示cmet及其编码蛋白极有可能是调控胰腺发育的功能蛋白，且其功能蛋白发挥作用有可能在大鼠胰腺发育的生后胰岛结构重塑阶段

【参考文献】
  ［1］ Habener JF, Kemp DM, Thomas SK,et al.Minireview :transcriptional regulation in pancreatic development［J］.Endocrinology,2005,146:10251034.

［2］ Schwitzgebel VM, Scheel DW, Conners JR,et al.Expression of neurogenin3 reveals an islet cell precursor population in the pancreas［J］.Development,2000,127（16）:35333542.

［3］ Hiscos,Jordan NJ,Jiang W,et al.Chronic exposure to fulvestrant promotes overexpression of the cMet receptor in breast cancer cells: implications for tumourstroma interactions［J］.Endocr Relat Cancer，2006,13(4):10851099.

［4］ Kohri T,Sugano M,Kawashima O,et al. Prognostic Model of Stage II NonSmall Cell Lung Cancer by a Discriminant Analysis of the Immunohistochemical Protein Expression［J］.Surg Today，2006,36(12):10391046.

［5］ Yang AD,Camp ER,Jiang W，et al.Vascular endothelial growth factor receptor1 activation mediates to mesenchymal transition in human pancreatic carcinoma cells［J］.Cancer Res，2006,66(1):4651.

［6］ Murray MJ , Lessey BA. Embryo implantation and tumor metastasis : common pathways of invasion and angiogenesis［J］.Semin Reprod Endocrinol,1999,17 (3) :275290.

［7］ Petruzzelli GJ. The biology of tumor invasion, angiogenesis and lymph node metastasis［J］ . ORL,2000 , 62 (4): 178185.

［8］ Atsushi S,Hiromitsu N,Hideki T.Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flowcytometric cell sorting［J］.Diabetes,2004,53(2)143215.

［9］ 倪雪峰,袁栎,程志祥,等.巢蛋白在大鼠胚胎、新生及成年胰腺中的表达变化［J］.第四军医大学学报, 2004,25( 3 ):193196.

［10］ Habener JF, Kemp DM, Thomas MK. Transcriptional regulation in pancreatic development［J］.Endocrinology, 2005,146(3):10251034.

［11］ Edlund H. Transcribing pancreas［J］.Diabetes, 1998,47:18171823.

［12］ Gines P, Li X, Zammaripa JL,et al.Tyrosine kinase growth factor receptors but not sevenmembrane spanning receptors or phorbol esters activate mitogenactivated protein kinase in rat hepatocytes［J］.Hepatology, 1995,22:12961303.

［13］ Adachi T, Nakashima S, Saji S,et al. Mitogenactivated protein kinase activation in hepatocyte growth factorstimulated rat hepatocytes: involvement of protein tyrosine kinase and protein kinase C［J］. Hepatology,1996,23:12441253.

［14］ Gomez Lechon MJ, Guillen I, Ponsonda X,et al.Regulation of amyloid precursor protein expression and secretion via activation of ERK1/2 by hepatocyte growth factor in HEK293 cells transfected with APP751［J］. Hepatology,1996,23:10121019.

［15］ Kim SK, Hebrok M. Intercellular signals regulating pancreas development and function［J］. Genes Dev,2001,15:111127.

作者单位：滨州医学院内科护理学教研室 滨州市 256603