NOS2和VEGF在骨关节炎滑膜组织中的表达及相关性研究

【摘要】  目的 检测血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)在骨关节炎（OA）滑膜组织中的表达及相关性情况。方法 回顾分析2003年1月—2004年9月我院骨科骨关节炎病理标本30例，女19例，男11例；对照组病理标本8例，男7例,女1例。应用免疫组化方法检测VEGF和NOS2在滑膜组织中的表达情况，并将结果用Spearman等级相关检验方法进行统计学分析。结果 骨关节炎组NOS2和VEGF的阳性表达率分别为60%和86.7%，VEGF和NOS2表达间的相关性有高度统计学意义（rs=0.516，P＜0.01）。结论 VEGF和NOS2在骨关节炎滑膜组织中的表达有相关性，VEGF和NOS2的表达率较正常组织为高，VEGF和NOS2改变是OA发生、发展的重要介导因素。

【关键词】  骨关节炎； 滑膜；一氧化氮合酶2；血管内皮细胞生长因子

    The expression of VEGF and NOS2 in the synovial membrane of osteoarthritis and their relationship

    CHEN Ningjie  XU Dongtan  ZANG Hongmin  et al

    Department of Orthopedics，Zibo Central Hospital,Zibo 255036

    【Abstract】  Objective  To investigate the expression rate of of NOS2 and VEGF in the synovial membrane of osteoarthritis(OA)and study the relathionship between the two factors.Methods  We retrospectively reviewed 30 patients who underwent osteoarthritis（case group）and 8 patients of control group from January 2003 to September 2004.Case group:male 11 cases,female 19 cases.Control group:male 7 cases,female 1 case.The synovial membrane of osteoarthritis  was immunohistochemically detected with VEGF and NOS2, respectively. The results were analyzed with Spearman's rank correlation.Results  The expression rates of NOS2 and VEGF were 60% and 86.7%,respectively. The correlation coefficient between VEGF  and NOS2 was statistically significant(rs=0.516,P＜0.01).Conclusion  The expression of VEGF  and NOS2 in the synovial membrane of osteoorthritis was statistically significant.The expression rates of  VEGF  and NOS2 in osteoarthritis  were higher than  those in normal tissues. The two factors were associated with destructive process in OA.

    【Key words】  osteoarthritis， synovial membrane，nitric oxide synthase 2,vascular endothelial growth factor

    骨关节炎（OA）的生物学行为涉及到分子生物学、细胞生物学和机械力学的许多方面，而细胞因子被认为在软骨基质的破坏上起了关键作用。在众多的合成类细胞因子中，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）最为引人注目。另外，Ⅱ型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 2 ,NOS2)与OA的关系也是近十年来的一个研究热点。本实验利用免疫组织化学方法对OA滑膜组织病理标本进行研究，着眼于上述因子在滑膜组织中的表达情况，并应用统计学方法对实验结果进行处理，以探讨它们之间的关系。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  随机抽取淄博市中心医院自2003年1月至2004年9月，符合骨关节炎诊断标准并经辅助检查证实的患者手术后滑膜病理标本30例，女19例，男11例,年龄52～75岁。对照组为非正常死亡及外伤性截肢的健康国人滑膜病理标本8例，男7例,女1例，年龄21～43岁。

    1.2  化学试剂  VEGF免疫组化试剂盒及NOS2免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

    1.3  方法  ① HE染色:观察OA滑膜的病理改变;②免疫组织化学染色:采用超敏SP免疫组织化学方法观察VEGF及NOS2在OA滑膜中的分布及变化。具体方法如下：标本常规脱蜡至水，先后加入过氧化物酶阻断溶液及正常羊血清孵育，并依次加一抗、生物素标记二抗、链亲和素过氧化物酶溶液及二氨基联苯胺（DAB）溶液，期间均充分水洗，苏木素复染封片观察。对照实验采用替代实验，用PBS替代一抗，余步骤同上述实验方法。

    2  结果

    2.1  判断标准  按照北大医学部病理科通用标准，免疫组织化学染色按阳性和阴性分类。阳性判断标准：以细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞，每张切片取3～5个较为典型者40×10倍视野进行观察，每个视野连续计数100个细胞，根据切片上细胞着色比例的不同分别标示为：阴性（－），无着色细胞或仅有<10%观察细胞着色，计为0分；弱阳性（±），阳性细胞数10%～25%，计为1分；阳性又分（+）为25%～50%阳性细胞数，计2分；（++）阳性细胞数50%～75%，计为3分；（+++）阳性细胞数75%～100%，计为4分。无颗粒出现或仅见片状或均匀黄染者可能是DAB沉积，而非真正阳性染色，应视为阴性。

    2.2  实验结果  对照组8例正常滑膜组织中，NOS2无阳性表达， VEGF有3例阳性表达，阳性表达率37.5%。病例组NOS2阳性者18例，阴性者12例，阳性表达率60%； VEGF阳性者26例, 阴性者4例，阳性表达率86.7%。注：阳性包括弱阳性至强阳性，即（±）、（+）、（++）及（+++）。

    具体实验结果见表1，NOS2、VEGF阳性表达见图1、2。表1  OA 滑膜组织中VEGF与NOS2的关系

    2.3  统计学处理  统计学检验应用T检验，使用SPSS统计分析软件：按照Spearman等级相关检验方法，先将表达指标由小到大列出等级，指标相同时，取平均等级。 然后求出每一对指标的等级差。最后用Spearman等级相关检验公式进行计算，得出相关系数，将该系数与等级相关系数的统计意义临界值表中临界值相比较，得出相关系数是否有统计意义的结论。计算列表和具体计算如下。由公式rs=6∑d2n(n2-1) （其中rs为等级相关系数，d为等级差，n为样本例数，自由度ν=n-2）。

    2.4  统计学处理结果  当样本例数n=30时，r0.05（28）=0.361， NOS2与VEGF 的rs=0.516，P＜0.01;NOS2与VEGF有高度相关性。

    3  讨论

    与OA关系比较密切的有合成及分解类细胞因子家族和NOS类，上述因子在OA组织中的表达情况的报道多限于软骨细胞及基质方面，且报道结果并不完全一致，对滑膜组织研究尚不深入。

    3.1  NOS与OA关系  Ⅱ型一氧化氮合酶 (iNOS，NOS2)与OA有关,NO主要有信使传导功能和细胞毒性因子功能,NO通过两种途径产生损伤作用，第一为高浓度的NO抑制与线粒体代谢有关的多种酶，引起对滑膜、软骨细胞的直接杀伤作用；第二是NO与超氧化阴离子O2生成过氧化亚硝基阴离子，在病理条件下，迅速分解为具有很强毒性的OH-和NO2自由基［1］。滑膜中丰富的成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等细胞，在炎性细胞因子的刺激下均可产生大量的NO。体外实验证实，当加入IL1β，TNFα等两种或两种以上的细胞因子后，活化滑膜中的iNOS，产生大量的NO。滑膜中高含量的NO可引起滑膜组织的损伤和血管扩张，同时，由血液进入组织中的巨噬细胞及中性粒细胞可释放出多种活性细胞介质，如PGE2也参与滑膜损伤，从而引起滑膜炎症，而滑膜炎可加速软骨基分解代谢，加速软骨退变。目前已经证实的是虽然OA的病因复杂并存在争议，但该病总伴有不同程度的滑膜炎症，滑膜炎在OA的发病中起着重要作用。

    近年来的研究认为，NO有双刃剑作用,低浓度的NO有强力扩血管作用并阻止血小板聚集及粘边，能促进滑膜血液循环，加快损伤组织修复;而高浓度的NO有细胞毒性作用，并促进细胞凋亡。此外，NO作为一种炎症因子，有很强的血管舒张和血管渗漏作用，但在一定条件下，NO通过抑制PGE2、IL6等炎症因子和细胞因子合成而发挥抗炎作用。但总的来说，在OA的发生、发展过程中，NO主要导致细胞的损伤和滑膜炎症，表明NO是OA软骨滑膜损伤的重要环节。iNOS或NO的抑制因子明显改变动物关节炎模型中关节的损伤程度和关节炎病程，抑制炎症及组织损害，例如NO可与氧合血红蛋白结合而失去活性，美蓝可阻断NO作用，地塞米松在适当浓度如1×10-6mol/L或1×10-7 mol/L时可抑制关节滑膜或软骨中NO产生，进一步表明NO是OA关节损伤的重要原因。

    3.2  VEGF与OA的关系  血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）主要由血小板、巨核细胞、内皮细胞和成骨细胞等分泌，VEGF的表达受细胞因子和胞外因子的调控［2］。一氧化氮正性调节VEGF的表达，促进VEGF对血管的通透和舒张作用［3］。反过来亦受VEGF正性调节，表明两者存在正性反馈回路。

    VEGF是一种特异性作用于内皮细胞与血管生长最为直接的生长因子，它主要通过促进内皮细胞、平滑肌细胞增生，刺激内皮细胞表达胶原酶及作为渗透因子增加细胞迁移，从而使新生血管形成。在OA合并滑膜炎早期，最早出现的病理改变：只有血管增生，此时滑膜的微血管数量显著增加，新生微血管主要为毛细血管及高柱状内皮的毛细管后微静脉，血管内皮细胞表达多种细胞粘附分子和细胞因子，为炎症细胞的不断进入提供了组织学基础，后期出现滑膜组织呈乳头瘤样增生，并有大量血管新生。当正常细胞损伤时，其自身促血管生成因子和抑制因子分泌的平衡状态被打破，细胞由此获得了诱导血管生成的能力以利于其生长。滑膜血管形成是正负调节因子之间平衡调节的结果。正调因子（VEGF、BGGF等）和负调因子（TSP1、血管抑制素）等自身可能被别的因子调节或通过别的因子发挥作用。研究表明［4］NO主要在VEGF调节的血管形成过程中发挥作用。Noiyi等［5］研究表明血管中VEGF和NO是一个反馈调节的相互的作用方式。动物实验表明［6］，VEGF在正常组大鼠滑膜组织中阳性细胞数量少，染色呈浅棕黄色；关节炎组大鼠滑膜VEGF阳性细胞数多，且染色呈深棕色；表达比正常组显著升高（P＜0.01）。而且在关节炎形成早期的关节组织提取物内含有大量VEGF，并以较强的生物活性形式存在。在OA病人中，滑膜的增生浸润以及导致后来出现的软骨和骨的破坏均依赖于滑膜内的血管生成；在整个病理过程中，VEGF起着促进血管生成和增加血管通透性的重要作用，它是OA发展过程中滑膜细胞增殖、血管新生、滑膜炎形成的重要炎症介质。

    3.3  OA滑膜组织中NOS2与VEGF在生物学作用上的关系  NOS2可在病理条件下产生大量NO，NO作为一种炎性介质和细胞毒性因子，可引起滑膜炎症，诱导并可直接引起滑膜、软骨细胞的杀伤和凋亡，导致软骨基质降解，最终导致OA的发生。其作用类似分解类细胞因子如IL1、TNFα的作用。而VEGF被定位于合成类细胞因子，可发挥对滑膜炎性反应调节，减轻炎症及细胞损害，并促进滑膜、软骨细胞及基质的增殖合成和分化，但在OA病程中却发挥炎性介质效应，同NO起相辅相成作用，导致滑膜炎形成及OA发生。这两种作用截然不同的因素之间有怎样的相互关系目前还不清楚。

    本研究中，应用等级相关检验对二者的表达情况进行检验，发现它们之间存在相关关系（rs=0.516，P＜0.01）。关于这种相关关系，可能的解释为NOS2与VEGF在表达的调控机制上不同，它们具有彼此独立的分子机制，反馈调节相互作用，但详细机制还不清楚，需进一步研究。

【参考文献】
  ［１］　邓晋丰,许宇猛.骨与关节退行性疾病的诊治［M］.北京：中国中医药出版社，1997:103106.

［2］ Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor regulation of angiogenesis［J］.Kidney Int, 1999, 56: 794814.

［3］ Lal BK, Varma S, Pappas PJ,et al.VEGF increases permeability of the endothelial cell monolayer by activation of PKB/akt, endothelial nitricoxide synthase and MAP kinase pathways［J］.Microvasc Res, 2001 ,62(3):252262.

［4］ GarciaCardena G, Folkman J. Is there a role for nitric oxide in tumor angiogenesis［J］?J Nati CancerInst,1998,90:560561.

［5］ Noiyi E，Lee E，Testa J，et al.Podokinesis in endothelial cell negration:role lf nitric oxide［J］.Am J Physiol，1998,274:C236C244.

［6］ 赵丽娟，马晓春，张宁，等.关节炎小鼠关节组织提取物对内皮细胞增殖影响及mVEGF的关系［J］.中国免疫学杂志，2002,18（6）:383385.

作者单位：淄博市中心医院骨科 淄博市 255036