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【摘要】 目的 检测NF2κB p65亚基（NFκB p65）和诱导型一氧化氮合成酶（NOS2）在去势雄兔干眼症模型泪腺组织的表达，探讨其与干眼症发病的关系。方法 制作6只去势雄兔干眼症模型,采用免疫组织化学SP方法对模型兔及6只对照兔泪腺组织中NFκB p65及NOS2蛋白的表达进行检测。结果 与正常对照组相比,干眼症模型兔泪腺组织NFκB p65、NOS2的表达明显增多(t′=9.38、9.16，P<0.01)。结论 去势雄兔干眼症模型泪腺组织中的免疫炎症反应可能是导致干眼症的主要发病机制，NFκB p65和NOS2在这一过程中可能起主要作用。
【关键词】 干眼病 模型 动物 转录因子RelA 一氧化氮合酶
EXPRESSIONS OF NFκB p65 AND NOS2 IN THE LACRIMAL GLAND OF CASTRATED MALE RABBITS WITH EXPERIMENTAL XEROPHTHALMIA
LIU CHAO, ZHANG ZHEN²HUA, GENG YAN
(Department of Ophthalmology, Qingdao Central Hospital, Qingdao 266042, China)
［ABSTRACT］ObjectiveTo detect the expressions of NFκB p65 and NOS2 in the lacrimal gland of castrated²male²rabbit mo²del with xerophthalmia and investigate their relationship with pathogenesis of this problem. MethodsThe experimental model was made in six rabbits. The expressions of NFκB p65 and NOS2 in lacrimal²gland tissue were determined. ResultsThe expressions of NFκB p65 and NOS2 in the models were prominently higher than that in the controls (t′=9.38,9.16;P<0.01). ConclusionThe immuno²inflammatory reaction in the model lacrimal gland is most likely leading to xerophthalmia, in which, NFκB p65 and NOS2 play a key role.
［KEY WORDS］Xerophthalmia; Model, animal; Transcription factor RelA; Nitric oxide synthase
干眼症又称角结膜干燥症[1]。近年来研究结果表明，基于免疫的炎症反应是各种类型干眼症发病的共同机制[2]，泪腺等眼表面的炎症可导致眼表上皮细胞损伤及凋亡[3,4]。泪液中水样液及黏液的成分改变，雄激素水平降低可能是导致此炎症反应发生的重要因素[5,6]，而NFκB p65亚基、诱导型一氧化氮(NO)合成酶（NOS2）是参与此过程的重要因子[7,8]。为此，本研究制作去势雄兔干眼症模型，对其泪腺组织标本进行NFκB p65亚基和NOS2表达的检测，旨在探讨干眼症的主要发病机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
取健康成年雄性新西兰大白兔12只，体质量(2.5±0.3)kg，由青岛市实验动物中心提供。随机分为去势雄兔组（实验组）和对照组，每组6只。
1.2 主要试剂
NFκB p65亚基多克隆抗体和NOS2多克隆抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供；SP试剂盒、DAB显色剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；其他试剂为进口或国产分析纯。
1.3 试验方法
实验兔用50 g/L的氯胺酮以50 mg/kg行肌肉注射麻醉，阴囊皮下加用20 g/L的利多卡因局部麻醉。将一侧睾丸由腹腔挤入阴囊并捏紧，勿使其滑动，用消毒刀片将阴囊切一小口，用力挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，切除睾丸及附睾，连续缝合阴囊皮肤后局部涂碘酊预防感染。另侧睾丸及附睾同法切除。对照组兔采用同样的麻醉方法和手术切口但不切除睾丸及附睾。
1.4 标本取材及处理
手术后3个月两组兔均以空气栓塞法处死后取双眼泪腺组织， 40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行苏木精²伊红（HE）染色。
1.5 检测方法
采用免疫组织化学SP法。石蜡切片常规脱蜡、水化，体积分数0.03的H2O2室温孵育20 min以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗3次，每次5 min；置0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液中进行微波抗原修复，温度保持在92～98 ℃，持续5 min；室温自然冷却，PBS冲洗3次，每次5 min；正常血清封闭非特异性抗原，37 ℃孵育20 min，倾去血清，滴加1∶100稀释的NFκB p65亚基，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃孵育20 min，PBS 冲洗3次，每次5 min；滴加三抗(工作液)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB 显色，苏木精复染，系列乙醇脱水、透明，中性树胶封片。阳性对照采用乳癌组织石蜡切片，阴性对照采用PBS液代替一抗。NOS2抗体检测方法同上，稀释度为1∶100。
1.6 观察指标
在400倍放大光镜下，以16 D目镜测微网面积(0.102 4 mm2)计数阳性细胞数，每个切片随机统计10个网格，取平均值作为NFκB p65亚基、NOS2表达的阳性细胞密度。
2 结果
NFκB p65亚基在泪腺的细胞胞核和胞浆表达明显，呈棕褐色，以胞核为主，弥漫或颗粒状分布，阳性着色细胞主要为泪腺上皮细胞，间质内有少量不连续表达；对照组极少表达；实验组和对照组泪腺阳性细胞密度分别为36.08±7.69和5.17±2.44，两组比较差异有显著性(t′=9.38，P<0.01)。NOS2主要在泪腺的间质中表达，连续弥漫性分布，呈棕褐色；阳性着色细胞较NFκB p65亚基少，以泪腺的炎症细胞着色为主，胞浆着色明显，而对照组表达微弱；实验组和对照组泪腺的阳性细胞密度分别为19.08±4.25和2.33±1.61，两组比较差异有显著性(t′=9.16，P<0.01)。
3 讨论
干眼症的发病机制尚未完全明确,目前大多数学者认为任何改变泪膜性质的因素均可导致基于免疫的炎症反应，并最终损害眼表上皮结构，产生干眼症[5]。ONO等[9]研究认为,泪腺上皮细胞为雄激素的靶细胞,雄激素可使泪腺细胞合成和分泌小片显著增加,促进IgA抗体在泪腺组织中聚集。罗丰年等[10]对去势雄兔眼表及泪膜的变化的研究结果显示，雄兔去势后随着睾酮水平的下降,其泪液分泌量也相应减少,两者间呈正相关，并且泪腺上皮细胞萎缩,腺泡泡状黏液物质消失,结膜杯状细胞减少。
本实验中NFкB p65亚基是转录因子kappa B(NFкB)的一个亚基，NFκB p65亚基的检测可间接反应NFκB的活化和表达。近来研究结果表明，在多种类型细胞中的基因启动子和增强子区域存在着NFкB的结合位点，NOS2启动子就是其中之一[11]。NOS2是重要的促炎症递质，但在正常生理情况下不表达或低水平表达。当受到炎症、免疫因子和细菌内、外毒素等刺激时经基因转录表达增加，并生成大量NO，NO发挥其细胞毒作用导致炎症损害、腺细胞萎缩、细胞凋亡。本实验结果显示，去势雄兔干眼症模型泪腺组织NFкB p65亚基及NOS2表达增加。作者认为雄激素水平降低可能通过NFкB活化，诱导NOS2基因的表达，产生大量的NO，损害泪腺组织和眼表上皮，导致干眼症的发生、发展。但雄激素通过何种途径影响NFкB的活性，尚有待进一步研究。
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作者单位：青岛市中心医院眼科，山东 青岛 266042