骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究进展

【关键词】  骨髓间充质干细胞；脑梗死；诱导分化

脑梗死是神经系统的常见病、多发病，病死率、致残率高，且极易复发［1］。目前临床对脑梗死的治疗尚缺乏有效的手段，寻找一种能从组织结构及功能上修复坏死神经元的种子细胞意义重大。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化成多种细胞［2］。随着BMSCs的体外培养成功、分离纯化、建立细胞系及定向诱导分化等技术的成熟，作为一种良好的种子细胞日益成为有关专家关注的焦点，与此同时它也为脑梗死患者的治疗提供了新的思路［3］。国内外有关骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究取得了一定进展，现结合相关文献作一综述。

    1  骨髓间充质干细胞的生物学特性

    间充质干细胞首先在骨髓中发现，是一类来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。大量的体外实验证明，在不同诱导条件下，间充质干细胞不仅可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，还可以向外胚层和内胚层来源的神经元样细胞和肝细胞样细胞分化［4～6］。

    迄今为止，BMSCs的表面标志尚未确定，利用流式细胞仪观察到的结果显示BMSCs的表面抗原具有非专一性，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，而不表达造血干细胞的表面标志。BMSCs对SH2、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD166等抗体呈阳性反应，对CD11b、CD14、CD31、CD34、CD45、CD133等则呈阴性［7～9］。其中SH2、SH3、SH4随着干细胞的分化而消失，具备一定的特异性。

    2  骨髓间充质干细胞神经分化潜能的研究

    国内外大量研究表明，BMSCs在体外、体内特定条件下可诱导分化为神经样细胞，这为其移植治疗脑梗死提供了理论前提。

    2000年，Woodbury等［10］在研究中将成年大鼠BMSCs 在体外培养繁殖20 多代，用β巯基乙醇诱导，结果显示其表达神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)、N乙酰神经氨酸（NeuN）、神经微丝蛋白（neurofilamentM，NFM）和氨基乙磺酸(tau)，在相同条件处理下人BMSCs 也可以分化成神经元。2001年Guo等［11］发现使用高度浓缩的2巯基乙醇能够诱导BMSCs分化成神经元样的细胞，分化后的细胞可以表达NF和NSE，这些神经元样细胞的碱性磷酸酶检测呈阳性，而其他未分化的干细胞则是阴性的，利用甲苯胺蓝涂染已分化的细胞未发现尼氏小体，说明这些细胞并不属于神经元谱系。2003年Hou等［12］将绿色荧光蛋白标记的成人BMSCs移植入帕金森模型大鼠体内，发现标记细胞生存时间超过70 d，在大鼠脑内的纹状体、胼胝体、对侧皮质甚至脑动脉血管壁都检测到标记细胞的存在，免疫细胞化学方法显示这些移植的标记细胞表达NF、NSE和神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP)。Joannides等［13］于2003年在海马星形胶质细胞的条件培养基中加入表皮生长因子和成纤维细胞生长因子可以极大地促进BMSCs向神经方向分化［13］。2004年，Tondreau等［14］利用FACS得到纯化的BMSCs并用一系列的抗体SH2、SH3、CD14、CD33、CD34、CD45等对其进行了筛选和鉴定，他们进而通过流式细胞术和RTPCR显示其向神经元方向诱导分化后的结果，证明细胞表达Nestin、TujI、betaIII Tubulin、tyrosine hydroxylase(TH)、MAP2和GFAP等。在细胞分化过程中持续表达未成熟神经元和神经胶质细胞蛋白Nestin、TujI，而细胞传了五代以后则开始较多表达成熟神经元和神经胶质细胞蛋白TH、MAP2和GFAP。同样，在2005年Long等做了类似的研究，结果表明在成神经细胞培养基中加入多种脑源性神经营养因子hEGF、bFGF、dbcAMP、IBMX、BDNF和bFGF8可以直接诱导BMSCs分化成神经样细胞。2006年Mareschi等［15］比较了几种条件培养基的神经分化效果：最低条件培养基/β巯基乙醇，最低条件培养基/维甲酸，最低条件培养基/二甲基亚砜（DMSO）+β丁羟基茴香醚。他们发现在β巯基乙醇组，分化细胞免疫表达NeuN、NSE、GFAP、Nestin，而其他两组只有NSE和Neun两蛋白表达阳性。

    3  骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的研究进展

    已有大量报道说静脉注射BMSCs可以明显改善脑梗死的局部血流，促进神经功能的改建，改善认知功能。近年来BMSCs在治疗脑梗死领域的研究已经取得了一定的成果。

    2004年Kurozumi等［16］用突变的F/RGD腺病毒载体将BDNF基因转染到BMSCs中，用大脑中动脉缺血梗塞模型模拟脑中风。MRI结果显示在移植后的7～14 d中，转染的细胞可以更显著地促进脑缺血部位的功能重建，缺血边缘带的TUNEL阳性率要明显少于对照组。Honma等［17］在2006年用端粒末端转移酶转染了BMSCs并将其从静脉输注至大脑中动脉梗塞模型中，用Morris水迷宫试验和平板试验检测大鼠的神经认知功能恢复，用MRI和MRS检测其损伤体积的大小，并观察组织学方面的改善，结果证明细胞能有效缩小脑梗死后的损伤体积及改善神经功能。2008年Onda等［18］在永久性脑缺损的大鼠模型建成6 h后，将成人BMSCs和血管生成素1(ANG1)转染的BMSCs通过静脉途径输入，发现都能明显改善损伤体积和程度。这两组都能促进损伤边缘区血管生成，而ANG1转染组的损伤处血流改善更明显及新生血管生成更多。2008年Theus等［19］用不死剂量的低氧预处理胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞，可以极大的增加其凋亡坏死的耐受性（40%～50%凋亡减少和caspase3活化），其增加了促红细胞生成素的分泌，并上调bcl2、低氧预处理因子、促红细胞生成素受体、神经微丝蛋白以及突触素的表达，低氧预处理的保护效果持续至少6 d。

    4  骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死机制的研究

    虽然目前国内外专家对BMSCs的研究产生了极大的关注，其治疗神经疾病方面已经取得了一定的成绩，但是其在体内转移分化相关机制以及修复脑缺损的机制现阶段所知甚为有限。

    已有多种文献报道BMSCs能够分泌各种营养因子：集落刺激因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子、脑源神经营养因子、白细胞介素(白细胞介素1、白细胞介素8、白细胞介素16)、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子、粒巨噬细胞集落刺激因子及胰岛素样生长因子1等。这些因子促进缺血部位的脑功能改善的原因可能有：减轻了缺血和再灌注早期的血管内皮细胞凋亡，维持了血管内皮结构的稳定，有利于减轻局部缺血程度，并促使血管平滑肌细胞产生一氧化氮，使血管松弛，增加了脑血流灌注，从而促进血管运送更多的氧和营养因子到局部缺血区，促进功能恢复；促进轴突生长、提高神经存活及抗损伤能力，还能够减少细胞内钙超载从而对低血糖和兴奋性中毒具有神经保护作用；抑制缺血半暗带细胞的凋亡、清除自由基、抗炎作用和抗谷氨酸兴奋性中毒作用，从而促进脑梗后神经功能的恢复［20～22］。但是这些因子在脑缺血损伤后究竟如何产生作用，是否有协同作用以及是不是这些因子起到主要的作用尚未有直接证据。但是以目前的研究现状来看，BMSCs分泌营养因子从而改善脑损伤这一机制是最有说服力的。

    5  展望

    脑缺血性损伤后，中枢神经系统坏死的神经组织不能自然恢复。内源性神经干细胞虽然能启动自发修复反应，但数量有限。诱导多能干细胞分化为新的目的组织细胞，进行细胞移植，或借助于体外培养扩增直接移植，以修复受损的脑组织，为脑缺血损伤的治疗提供了新方法。目前用于中枢神经移植的供体细胞主要有胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞及脐血干细胞等。而BMSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，免疫原性弱，易于从骨髓中分离、纯化及体外扩增等特点，越来越受到人们的重视。但仍存在很多问题，例如实验研究主要以动物为对象，由于动物模型与人体疾病存在一定的差异，故间充质干细胞真正用到临床仍有相当距离；体外诱导分化的机制，定向诱导分化以及原位诱导迁移举步维艰；BMSCs发育和分化中基因的表达变化和信号的传导与调节也是今后主要的研究方向。尽管如此， 仍有理由相信随着神经生物学、分子生物学以及人类基因组学等相关学科的发展，BMSCs诱导分化潜在的分子生物学机制逐渐阐明，BMSCs应用于临床治疗中枢神经系统疾病打下基础。

【参考文献】
  ［1］ Giroud M, Beuriat P, Becker F,et al.Dense middle cerebral artery: etiologic significance and prognosis［J］.Rev Neurol (Paris)，1990，146(3):224227.

［2］ Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN,et al.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs［J］.Exp Hematol,1976,4（5）：267274.

［3］ Chen J, Li Y, Chopp M. Intracerebral transplantation of bone marrow with BDNF after MCAo in rat［J］.Neuropharmacology，2000，39(5):711716.

［4］ Post S, Abdallah BM, Bentzon JF,et al.Demonstration of the presence of independent preosteoblastic and preadipocytic cell populations in bone marrowderived mesenchymal stem cells［Ｊ］.Bone, 2008，30：110114.

［5］ Choi D, Kim JH, Lim M,et al.Hepatocyte-like cells from human mesenchymal stem cells engrafted in regenerating rat liver tracked with in vivo magnetic resonance imaging［J］.Tissue Eng Part C Methods, 2008, 14(1):1523.

［6］ Kermani S, Karbalaie K, Madani SH,et al.Effect of lead on proliferation and neural differentiation of mouse bone marrowmesenchymal stem cells［J］.Toxicol In Vitro, 2008, 22 (4):9951001.

［7］ AméThomas P, Deschaseaux F, Mauny F,et al.In vitro functional defects of bone marrowderived CD34+ progenitors from newly diagnosed mature Bcell malignancies with bone marrow tumor involvement［Ｊ］.Exp Hematol, 2005, 33(3):318328.

［8］ Polk EE, Wexler SA, Kymes S. Incidence of corneal epithelial defects with the standard and zerocompression hansatome microkeratomes［J］.J Refract Surg, 2005, 21(4):359364.

［9］ Lee J, Wecker A, Losordo DW,et al.Derivation and characterization of bone marrowderived multipotent stem cells［J］.Exp Hematol, 2006, 34(11):16021603.

［10］Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ,et al.Adult Rat and Human Bone Marrow Stromal Cells Differentiate Into Neurons［J］.J Neurosci Res, 2000, 61(4):364370.

［11］ Guo ZK, Liu XD, Hou CM,et al.Human bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into neuronlike cells in vitro［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 2001,9(1):9192.

［12］ Hou LL, Zheng M, Wang DM,et al.Migration and differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in the rat brain［J］.Sheng Li Xue Bao, 2003,55(2):153159.

［13］ Joannides A, Gaughwin P, Scott M,et al.Postnatal astrocytes promote neural induction from adult human bone marrowderived stem cells［Ｊ］.J Hematother Stem Cell Res, 2003,12(6):681688.

［14］ Tondreau T, Lagneaux L, Dejeneffe M,et al. Bone marrowderived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation［J］.Differentiation, 2004, 72(7):319326.

［15］ Mareschi K, Novara M, Rustichelli D,et al.Neural differentiation of human mesenchymal stem cells: Evidence for expression of neural markers and eag K+ channel types［J］.Exp Hematol, 2006, 34(11):15631572.

［16］ Kurozumi K, Nakamura K, Tamiya T,et al. BDNF genemodified mesenchymal stem cells promote functional recovery and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model［J］. Mol Ther, 2004, 9(5):766.

［17］ Honma T, Honmou O, Iihoshi S,et al. Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat［J］.Exp Neurol, 2006, 199(1):5666.

［18］ Onda T, Honmou O, Harada K,et al.Therapeutic benefits by human mesenchymal stem cells (hMSCs) and Ang1 genemodified hMSCs after cerebral ischemia［J］.J Cerebr Blood Flow Metab, 2008, 28(2):329340.

［19］ Theus MH, Wei L, Cui L,et al.In vitro hypoxic preconditioning of embryonic stem cells as a strategy of promoting cell survival and functional benefits after transplantation into the ischemic rat brain［J］.Exp Neurol, 2008, 210(2):656670.

［20］ Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q,et al. VEGF enhances angiogenesis and promotes bloodbrain barrier leakage in the ischemic brain［J］.J Clin Invest, 2000,106(7): 829838.

［21］ Ang ET, Wong PT, Moochhala S,et al.Neuroprotection associated with running: is it a result of increased endogenous neurotrophic factors［J］.Neuroscience, 2003, 118(2):335345.

［22］ Hirouchi M, Ukai Y. Current state on development of neuroprotective agents for cerebral ischemia［J］.Nippon Yakurigaku Zas shi, 2002, 120 (2):107113.

作者单位：滨州医学院组织学与胚胎学教研室 滨州市 256603