新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义

【摘要】  目的 观察新生鼠窒息后缺氧缺血再灌注损伤不同时间脑组织NFκB动态变化，以探讨NFκB信号途径在新生儿窒息脑损伤中的作用。方法 出生7 d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组);制备新生鼠窒息模型，并于窒息后1、3、5和7 d取脑组织行石蜡切片。采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织NFκB p65活性表达水平，用苏木精伊红染色观察窒息后脑组织形态学变化。结果 B组脑组织NFκB的表达较A组显著增强(P<0.05),以5 d时升高最明显;并伴有神经细胞坏死及凋亡现象。结论 NFκB可能通过炎症反应机制介导窒息脑损伤过程。

【关键词】  NFκB;窒息;新生鼠;缺氧缺血再灌注损伤; 脑组织

The expression and significance of NFκb in hypoxia ischemia reperfusion brain injury of newborn rats with asphyxia

　　ZHANG Dingrong1 ZHANG Haihong2 CHE Fenfang1 et al

　　1 Department of Pediatrics,People's Hospital of Jimo 266200;2 Department of Pediatrics,Affiliated Hospital of

　　Binzhou Medical University

　　【Abstract】 Objective To observe the activation of NFκB in hypoxia ischemia reperfusion brain injury of newborn rats with asphyxia. The aim of study is to explore the effect of NFκB signal pathway on brain injury of newborn with asphyxia, so as to provide the experimental base for finding clinical treatment of asphyxia,in which NFκB is taken as the target.Methods newborn rats(7 days old)were randomly divided into control group (A) and asphyxia group (B).The model of asphyxia was induced in B group .Immunohistochemical method was used to detect the activity of NFκB P65 in the brain of the newborn rats,and hematoxylineosin staining was perform ed to observe the histological evidence of asphyxia in the brain.Results The activity of NFκB P65 was higher in group B than that in group A(P<0.05),increased to the highest peak at 5 d,with nerve cell death and apoptosis in group B.Conclusion The NFκB,may play an important role in brain injury with asphyxia.

　　【Key words】 NFκB，asphyxia, newborn rats, hypoxia ischemia reperfusion, brain tissue

　　脑组织中的NFκB能被许多因素激活，其中包括窒息后脑组织缺氧缺血再灌注损伤。近年来的研究发现NFκB还存在于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞中，在调节炎症反应的基因中起关键作用，与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关[1]。本实验建立新生鼠窒息动物模型，旨在探讨NFκB信号途径在新生鼠窒息中的作用，为进一步治疗新生儿窒息提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 七日龄Wistar大鼠25只，由青岛市市立医院动物中心提供，雌雄不限，体重12～20 g。按同窝随机分成两组：对照组5只(A组)，窒息组(B组)20只，窒息组又分为4个亚组(Ba、Bb、Bc、Bd)，即分别于窒息后1、3、5和7d处死动物，每个时相点各5只。各组间体重无显著性差异(P>0.05)。

　　1.2 动物模型的建立 ①窒息动物模型：为更接近新生儿窒息病理过程(缺氧缺血再灌注损伤)，根据新生鼠常压窒息模型[2]，将实验动物分别置于容积为55 ml的缺氧瓶(即磨口瓶，保证密闭性)中，内装0.005 kg钠石灰，待动物安静后，塞紧瓶塞,密闭30 min后，立即氧罩吸氧2 h(氧浓度50%～60%)，之后放回笼中，仍由母鼠哺乳喂养。②对照组动物模型：模拟上述过程不塞紧瓶塞，仍由母鼠哺乳喂养。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本采集：分别于窒息后1、3、5和7d迅速横断各组新生鼠脊髓，在冰盘上快速取全脑组织，以冰生理盐水清洗至无血迹，切取含有海马组织的脑片，所有标本均经10%的中性福尔马林固定，经58～60℃石蜡包埋后，连续切片2张，厚度为4 μm，烤片30 min，供免疫组化和病理检查用。

　　1.3.2 新生鼠脑组织NFκB p65蛋白活性检测：采用免疫组化法，标本测定一次完成。测定步骤：①组织切片;②3%H2O2去离子水孵育;③蒸馏水冲洗;④80%火力微波修复;⑤PBS洗3次;⑥滴加正常山羊血清封闭液;⑦滴加适当稀释的一抗;⑧PBS振洗3次;⑨滴加生物素化二抗工作液;⑩PBS振洗3次;滴加三抗SA/HRP;PBS振洗3次;DAB显色;苏木素复染细胞核;梯度酒精脱水，中性树胶封片。免疫组化同时加作阴性对照片(PBS代替一抗)。

　　1.3.3 脑组织形态学检查:苏木精伊红(HE)染色用于观察脑组织形态学改变，脑细胞损伤情况，帮助判断坏死和凋亡细胞。

　　1.4 统计学处理 所得数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理，进行多因素方差分析，两组间比较用t检验，P<0.05差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 NFκB p65结果判断 阳性细胞为细胞核染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积，定位于细胞核和细胞浆。由二位病理医生按双盲法对免疫组化结果进行评估，即在高倍镜下(×200)随机观察10个视野,计数1 000个细胞中的阳性细胞数，计算出阳性细胞百分率，免疫组化染色图片见图1、2。

　　2.2 脑组织病理学判断 参照图谱[1]，①正常神经细胞结构：锥体细胞呈椭圆型，核染色质疏松，核仁清楚;②神经细胞损伤：胞体缩小，呈三角形或长条形，胞核固缩深染，核仁消失，细胞与周围间隙增宽。

　　2.3 神经症状评分 从缺氧开始观察24 h，观察异常神经症状并进行评分。评分标准[4]:竖毛震颤，运动减少各计1分;瘫痪、旋转、抽搐各计3分;昏迷计6分。结果见表1。A组无神经系统症状，而B组出现明显神经系统症状(P<0.05)，B组各亚组与A组相比均有显著性差异(P<0.05)，以Bb及Bc组最显著，Bd组趋于稳定，随时间延长，在一定时间后神经症状可能逐渐好转，但未作进一步观察。

　　表1 各组异常神经症状评分 (x±s,n=25) 组别 n 异常神经症状评分 t值 P A 5 0 Ba 5 6.40±1.51 9.657 <0.05Bb 5 8,42±1.32 8.625 <0.05Bc 5 9.84±2.10 12.624 <0.05Bd 5 8.24±1.63 10.032 <0.05 2.4 病理检查 A组:外观及病理检查均正常。B组:肉眼观察脑表面苍白，切面上可见水肿，偶见点状出血。HE染色光镜下见各亚组不同程度组织形态学改变，见炎细胞浸润，细胞水肿,变性，及坏死现象;细胞皱缩，细胞核固缩，胞浆疏松，结构不清等凋亡改变。

　　2.5 脑组织NFκB p65蛋白活性表达(见表2) A组:活性表达为6.00±1.58。B组:各时相点与对照组比较活性均有增加(P<0.05)，见表2。实验1 d即增高，实验第5天升高最明显，为A组的5～6倍，7 d已开始降低;不同时间点之间除3 d组和5 d组之间无统计学意义外，其他各时相点之间均有显著性差异(P<0.05)。表2 A组与B组NFκB p65阳性细胞比较

　　2.6 脑组织NFκB p65蛋白活性表达与病理改变之间的关系 NFκB p65蛋白活性与病理改变不一致，NFκB p65蛋白活性在Ba、Bb、Bc呈逐渐增加，Ba、Bb组细胞坏死现象明显，Bc、Bd组细胞凋亡现象逐渐明显。Bd组NFκB p65蛋白活性已开始下降，神经细胞凋亡现象也趋于稳定。

　　3 讨论

　　核因子κB(nuclear factor kappa B,NFκB)是一种重要的转录因子，存在于真核细胞中，具有广泛的生物活性，激活后可促进许多细胞因子、黏附分子等基因的转录，在机体的免疫应答、炎症反应和细胞的生长发育等方面发挥着重要作用 [4]。在窒息所造成的缺氧、缺血过程中，恢复血流可避免细胞死亡和组织损伤，但在长时间严重缺氧、缺血基础上，恢复血流会引起更剧烈的损伤，即再灌注损伤。本研究表明，新生鼠窒息30 min，复氧1、3、5和7 d四个时相点，NFκB的活性均明显增高，说明在窒息新生鼠脑组织存在NFκB激活。Stephenson等[5]用凝胶电泳迁移分析试验发现脑缺血再灌注0.5 h后NFκB的活性即明显升高，6 h达到高峰，24 h降到1 h的水平。本实验表明NFκB在窒息复氧后1 d即明显升高，5 d时达高峰，以后逐渐下降，但7 d时仍明显高于对照组。造成两者试验结果有差异的原因可能与动物模型不同，缺氧缺血时间不同，引起的缺血程度以及再灌注时间与程度不同有关。本研究发现NFκB与神经细胞损害病理改变密切相关，随着NFκB的升高神经细胞损害,坏死及凋亡现象明显，早期以细胞坏死为主，后期则已调亡为主。7 d时NFκB开始下降，病理改变也趋于稳定好转。说明NFκB参与了这一病理损害过程,NFκB的激活可能对病理改变的控制和恢复有促进作用。

　　NFκB在神经系统中广泛表达，细胞受到外界刺激，如：炎症、创伤、缺血再灌注等损伤后NFκB激活，在脑缺血再灌注损伤中NFκB可被许多因子激活，包括炎症细胞因子TNFα、IL1、氧自由基和细胞内钙增加等[6]。

　　本试验证明窒息新生鼠海马区凋亡增加，且伴随着NFκB活化表达的增高，提示窒息后NFκB的激活与细胞凋亡有关。Schneider等[7]为了研究NFκB在神经元死亡中的作用，观察了啮齿动物卒中模型的NFκB的活性，发现在缺血半球NFκB被激活的p50敲除鼠，缺血损害显著减轻。缺血缺氧后神经细胞的死亡主要分为早期的坏死和继发性细胞凋亡，本研究Ba、Bb组以坏死为主，Bc、Bd组以调亡为主也证明了这一点。NFκB的活化对阻止细胞凋亡，改善病理变化的有力的炎性机制反应。缺血缺氧损伤后机体通过抗损伤机制在一定程度上诱导NFκB的活化来对抗损伤，随着损伤的稳定好转NFκB也由于刺激减弱而活性降低。

　　新生儿窒息可导致新生儿脑缺氧缺血损伤，病死率和后遗症率高，是新生儿期造成伤残儿童的主要原因之一。据此推测NFκB的活化与新生儿窒息后脑损害相关，NFκB的活性可能对避免或减轻窒息后脑损害有治疗作用。

【参考文献】
  　　[1] Nolan B,Collette H,Baker S,et al.Inhibition of neutrophil apoptosis after severe trauma is NF kappa beta dependent[J].J Trauma,2000,48(4):599604.

　　[2] 董文斌，冉隆瑞，冯志强，等.生脉注射液对窒息后脑损伤保护作用的研究[J].中华儿童保健杂志，1998,6(1):3234.

　　[3] Barnes PJ,Karin M.Nuclear factor NFκB pivotal transcription factor in chronic inflammatory disease[J].N Engl J Med,1997,17:39.

　　[4] Seegers H, Grillon E, Trioullier Y,et al.Nuclear factor kappa B activation in permanent intraluminal focal cerebral ischemia[J].Cere Blood Flow Metab,2000,20(3):592594.

　　[5] Stephenson D, Yin T, Smalstig EB,et al.Transcription factor Nuclear Factor kappa B is activated in neurons after focal cerebral ischemia[J].Cere Blood flow Metab,2000,20(3):592603.

　　[6] Rroll JE,Howard EF,Hess DC,et al.Nuclear factorκb activation during cerebral reperfusion effert of attenuation with Nacetylcysteine treatment[J].Brain Res Mol Brain Res,1998,56(12):186191.

　　[7] Schneider A,MartinVillalba A.NFkappa B is activated and promotes cell death in cerebral ischemia[J].Nat Med,1999,5(5):554559.

作者单位：1 即墨市人民医院儿科 266200;2 滨州医学院附属医院儿科;3 青岛市市立医院儿科