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摘要:目的 了解我国东北的HTLV-1的流行情况及病毒特征。 方法 从2002年起在东北地区共采取了941份标本，用免疫荧光法进行了血清抗体的检测，经PCR扩增及Southern杂交鉴定。 结果 发现3例HTLV-1阳性感染病人，阳性率0.3%，没有发现HTLV-2阳性感染病人;在37例淋巴细胞白血病患者中检出2例，检出率5.4%。并对其中1例阳性感染病人的外周血单个核细胞（PBMCs）中的前病毒DNA的env基因的gp21、gp46两个碱基对核甘酸序列进行了PCR扩增，并将其克隆到T-Vector上进行DNA的核甘酸序列测定，与日本原型（ATK）病毒DNA链的相应区域的线性比较显示了很高的同源性（98.9%～100.%），没有发现碱基的插入、删除和其他显著性的变化。 结论 东北地区为HTLV-1的非流行区，于淋巴细胞白血病病人检出率（5.4%）较高，说明东北地区的淋巴细胞白血病与HTLV-1感染有一定的关系。
关键词:人嗜T淋巴细胞白血病病毒;多聚酶链反应;克隆
Determination and significance of retrovirus DNA of HTLV-1in northeast China region.
YUE Xi-quan，SHI Hong，YANG Li-fang.
（Department of Infection of Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin132011，Jilin，P.R.China）
Abstract:Objective Human T cell leukemia-1ymphoma virus type1/2（HTLV-1/2）is associated with adult T-cell leukemia（ATL）and tropicas spastic paraparesis/HTLV-1-associated myelopathy（TSP/HAM）and other clinical diseases.High prevalences of HTLV-1infection has been found in Japan and other areas To gain the epidemiological presence and viral characterza-tion. Methods Antibodies to HTLV-1/2were investigated941individuals living in Eeast-North of China.The blood from pa-tients with virious neurological diseases，leukemia and health person.Antibodies were determined by an inmunoflurescence method，and positive reactions were confirmed by PCR and southern hybridization for the pol gene of the proviral DNA. Results The pres-ence of HTLV-2in941samples（0%），THE PRESCENE Of HTLV-1（0.3%）. Conclusion The HTLV-1strauns for Esast-Nonth of China were98.9%idental to Japaues prototype ALK.
Key words:HTLV-1;PCR;Colone
由于HTLV-1与艾滋病病毒（HIV）有相似的传播途径，并且经常与HIV混和感染，故在世界范围内发现HTLV-1的感染人群有增加趋势。已经证实HTLV-1与成人T细胞白血病（ATL）和热带痉挛性瘫痪（TSP）即HTLV-1相关性脊髓炎（HAM）有关 ［1，2］ 。由于目前还缺乏对HTLV-1相关疾病治疗的有效手段，故分子流行病学研究为HTLV-1的分子生物学和致病机制的研究打下基础，也为进一步研究本地病毒株的疫苗提供帮助，我国在HTLV-1方面的工作较少 ［4，5］ ，鉴于我国东北地区与日本理位置上的接近和两地区历史上传统的关系，为此对我国东北地区的HTLV-1/2的流行状况进行了调查研究。
1 材料与方法
1.1 调查对象 共调查941人，来自我国东北黑龙江、吉林、延边及辽宁等地区。白血病患者77例。其中淋巴细胞白血病37例，粒细胞白血病32例，其他8例。神经系统疾病患者418人。献血员80人。正常 人366人。
1.2 试剂和酶 白细胞分离液，荧光抗人IgG，蛋白酶K购自中国华美公司;Agrose，PCR试剂（Buffer，Mg-cl2，4×dMTP），硝酸纤维素滤膜，T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶，限制性内切酶，X—gal，IPTG，超纯低熔点琼脂糖购自美国Promega公司;DIGTN非同位素DNA标记和检测度剂盒购自BathringerMamnhelm公司。
1.3 细胞、质粒和宿细菌 JM109，MT-2T和C-9由中国预防医学科学院病毒所陈国敏老师赠送，PGEM-T Vector购自美国Promega公司。
1.4 HTLV-1/2抗抗体的血清学检测 用间接免疫荧光法（IIF）进行。
1.5 前病毒DNA的提取 白细胞的分离取IIF检测HTLV-1血清抗体阳性者血10-15ML，按常规操做。从PBMCS中提取前病毒DNA。收集的一定量PBMCS，按提取DNA方法实施。取部分DNA溶液在0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察测定吸收率推测DNA浓度。
1.6 PCR引物的设计合成 引物设计参照已知的前HTLV-1DNA链全序列ATK ［3］ ，SK110/SK111引物中国预防医学科学院病毒所陈国敏老师赠送，env1/env2，env3/env4引物由中国预防医学院合成。SK110/SK111引物配对用于检测env1/env2，env3/env4配对用于克隆。
1.7 HTLV-1env基因部分DNA片段的PCR扩增 以PBMCS中提抽的高分子量DNA为模板，进行PCR扩增。
1.8 探针标记及PCR产物的Southern杂交。HTLV-1全env基因探针由美国NIH Reitz教授惠赠。按照DIG-DNA非同位素标记与检测试剂盒说明书用DIG-11dUTP进行探针标记。
1-9 PCR产物的克隆及测序 PCR目的产物的回收，连接、转化、感受态菌的制备，重组质粒的提取和酶切鉴定等技术以及核苷酸序列测定技术均见“分子克隆实验指南”。
2 结果
2.1 血清学检测结果 941份标本抗体检测HTLV-1，3例强阳性，见表1。表1 HTLV-1/2抗抗体的I I F检测结果（略）
3例HTLV-1抗体血清检测阳性的患者为:例1、汉族成年男性，白血病患者，生于吉林市，无异地居住史，否认家族遗传史。例2、汉族成年男性，临床诊断为血清阴性脊柱关节病，病情加剧时有淋巴结肿大。例3、朝鲜族成年男性，急性淋巴细胞白血病，病人于1995年4月合并感染而死亡。
2.2 PCR扩增 诊断用小片段PCR引物SK110/ SK111引导的PCR扩增，3例抗体血清检测强阳性标本的前病毒DNA的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳和EB染色，在紫外光下可见单一特异的荧光高带，PCR产物约12bp长，与原设计相符。
上述3例标本前病毒DNA在env1/env2，env3/env4引物引导的PCR扩增，PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳和EB染色，在紫外光下可见特异的荧光光带，产物片段的大小（env1/env2:370bp;env3/env4:400bp）均与原设计相符。
2.3 Southern杂交鉴定PCR产物 PCR产物经South-ern印迹转移至硝酸纤维素滤膜上，方法见“分子克隆实验指南”，按照DIG-DNA非同位素标记与检测试剂盒说明书用DIG标记的HTLV-1env全基因探针进行Southern杂交检测，发生强阳性特异反应，表明PCR产物是其HTLV-1前病毒DNA中env基因的部分对应序列。
2.4 PCR产物的克隆及酶切鉴定 用一个标本的env1/env2，env3/env4两对引物导的PCR产物分别扦入到PCEM-T vector载体中，分别转化大肠杆菌JM109钙化菌中，重组质粒经sph I/pst I双酶切消化，电泳后，分别可出现约370bp和400bp的DNA条带。2.5 序列测定及与日本原型病毒DNA链（ATK）等的比较 阳性克隆提取的重组质粒DNA纯化后送至中国农业大学测序中心测序，结果表明所克隆的DNA片段，为HTLV-I env基因的一部分，分别为370bp和414bp，其核苷酸序列同已发表的日本原型病毒ATK，TSP-1以及加勒比海地区的CH，巴布亚新内亚MEL-1等基因组的相应区段进行线性比较，同源性很高。结果见图1（略）。
3 讨论
从本文总的研究结果来看，虽然我国东北地区为HTLV-1的非流行区，但也有阳性感染人群存在，东北地区的HTLV-1与日本原型病毒株（ATK）有密切的关系。
血清学检测和分子生物学检测941人中，有3人是HTLV-1阳性感染，感染率为0.3%，HTLV-2的血清学检测无阳性，说明东北区为HTLV-1/2的非流行区。检测的结果还显示，3例HTLV-阳性感染人分别是白血病病人和神经系统疾病病人，淋巴细胞白血病的病毒感染率（5.4%）显示本地区白血病与HTLV-1具有一定的关系 ［6］ 。
在HTLV-1env基因gp21，gp46区域进行的核苷酸序列顺序检测，通过与ATK，Tsp-1，CH，MEL-1等病毒毒株进行的线性比较，除MEL-1亚型有较大的变异度外（7.6%），中国东北地区HTLV-1感染人的 日本前病毒DNA序列中只发现很少的碱基就化，在669bp长度的序列中只有7～8个bp改变，变异度大约1%，并且没有发现碱基的扦入，缺失和可能引起特殊反应的序列碱基变化，与日本原型病毒株ATK比较，同源性达98.9%，显示了相当亲密的同源关系。
在36例朝鲜人群可能存在较高的HTLV-1流行，这需要进一步的研究。另外，国内以前的HTLV-1流行病研究，多以血清学方法为主，而血清学方法虽然敏感，但特异性较差，易出现假阳性。从本文中看血清学测出现3例R HTLV-1抗体感染阳性，经PCR扩增检测。因此，认为临床血清学HTLV-1env基因的部分序列，这两段序列基因分别编码病毒的外膜gp21，gp21蛋白，进一步的工作如果将这两片段基因进行克隆表达，表达的蛋白用作HTLV-1的诊断试剂 有一定的研究意义。
参考文献:
［1］Sandler SG.Retroviral infections transmittal by blood tronfusion［J］.Yale JBiol Med63:353，1990.
［2］R.Mahieaxc.Serepidemiology.Virol isolation and molecalar characteriza-tion of HTLV-1from La Reanion Island.Indian Ocean［J］.ALDS Res Human retroviruses.10:745～751.1994
［3］Wang-Steal and Callo Rc，Human T lymphotropic retrovirus［J］.Nature，
1985，317:395～403.
［4］何士勤，张荣艳，尚承京，等.白血病病人HTLV-1型抗体和抗原检测临床意义［J］.江西医药，1995，01.
［5］曾毅，卓家才，杨木，等.成人T细胞白血病病毒抗体的血清流行病学调查［J］.病毒学报，1985.1:344～348.
［6］吕联煌.福建地区人类T淋巴细胞白血病小流行区域的发现［J］.中华血液学杂志，1989，10:225.
作者单位:北华大学附属医院感染科，吉林 132011.
作者简介:岳希全（1953～），男，副教授、副主任医师，北华大学传染病教研室主任，主要从事传染医疗和教学.
收稿日期:2005-04-10