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摘要:目的 探讨湛江地区不同人群中TTV的感染状况及部分TTV的基因序列。 方法 应用PCR检测512份正常献血员血清标本、60份HBsAg阳性血清标本和48份抗-HCV阳性血清标本的TTV感染状况，并对部分扩增出的阳性片段进行克隆测序，与国内外报道的序列进行同源性比较。 结果 正常献血员、HBsAg阳性、抗-HCV阳性标本的TTV DNA阳性率分别为10.94%、13.33%和16.67%，不同人群间结果无显著性差异（P>0.05）;随机选出的5例TTV DNA阳性片段，其序列显示与日本株（AB008394）和中国株（TTV CH1）相应位置核苷酸序列的同源性大于97%，可能属同一基因型。 结论 湛江地区不同人群TTV DNA与HBsAg阳性、抗-HCV阳性无明显相关。
关键词:献血员;TTV;“套式”PCR;核苷酸序列
Detection of TTV and analysis of partial gene of TTV in sera from different groups.
CAI Shu，LI Guo-ming，LUO Jun，et al.
（Zhanjiang Municipal Central Blood Center，Zhanjiang524002，Guangdng，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate status ofTTV infection and analysis of the gene sequence from different groups in Zhanjiang City. Methods The512samples from blood donors，60from HBsAg positives and48from anti-HCV positives were collected and detected for the infectious status of TTV，and some of the sequence of positive fragments amplified were analyzed by using PCR. Results The positive rates ofTTV DNA in these three groups were10.94%，13.33%and16.67%，respectively.There were no significant difference among the three groups（P>0.05）.The sequence analysis showed that there were above97%nucleotide iden-tity among AB008394（from Japan），TTV CH1（from China）and our5isolates. Conclusion The positive rate of TTV DNA was not obvious correlated with the positive rates of HBsAg and anti-HCV in different groups of Zhanjiang City.
Key words:Blood donors;Transfusion-transmitted virus;Nested-polymerase chain reaction;Nucleotide sequence
1997年，Nishizama等利用代表性差异分析法（RDA）从1例病原不明的输血后肝炎患者（TT）血清中分离到一新型人类肝炎病毒，命名为TTV，并在3例转氨酶升高的非甲至庚型输血后肝炎患者中检测到TTV DNA ［1］ 。由于该病毒可引起输血后肝炎，且国外也陆续报道在血库血液中有较高的阳性率。因此，血源污染有可能是该病毒传播的主要途径之一。1998年初，我国学者周育森等 ［2］ 亦从非甲-戊型肝炎病人中分离出TTV。同年，Okamoto ［3］ 报道了TTV全序列。为进一步了解湛江地区不同人群中TTV的感染状况和TTV DNA的基因序列，我们应用PCR法对正常献血员、HBsAg阳性人群及抗-HCV阳性人群进行了TTV感染的检测，并对部分TTV的基因序列作了同源性分析，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源 共检查湛江地区620份血清标本，其中正常献血员血清标本512份，HBsAg阳性血清标本60份，抗-HCV阳性血清标本48份。其中男性384人，年龄21～45岁，平均32±9岁;女性236人，年龄19～42岁，平均29±8岁。标本采集和血清分离全部 采用一次性消毒器械，分离血清置-20℃保存备用。
1.2 献血员一般筛查 所有献血员常规检测ALT（速率法），ALT>40U/L为异常，试剂盒购自澳斯邦生物工程公司;HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、梅毒抗体采用ELISA检测，试剂盒购自荷兰欧嘉隆科技有限公司、英科新创科技有限公司和美国雅培制药有限公司。
1.3 TTV DNA模板提取 血清和蒸馏水各50μl混匀稀释后，加入100μl裂解液（25mmol/L NH 4 Ac，2.5mmol/L EDTA，1%SDS，2mg/ml蛋白酶K），68℃消化2h后，常规苯酚和氯仿抽提。无水乙醇沉淀，真空抽干，溶于20μl TE中，-20℃备用。
1.4 PCR扩增TTV DNA 采用“套式”PCR法。TTV引物位于ORF1区，参照Nishizawa T等 ［1］ 报道的序列，由上海生工合成。P1:5'-ACCGCAGCGGATATG CAA-TA-3';P2:5'-TACTTAGCCAGTCTATCCACAGCA-3';P3:5'-GTTAACTTCCAAGTTCAGCAATCC-3';P4:5'-GTTGCCTTCTCCTCTGTCTG-3'。第一轮PCR反应条件:dNTP各0.2mM;P1/P2各0.35μM;2UTaq DNA聚合酶;2mMMgCI 2 ;模板5μl，反应体系总体积100μl。94℃预变性6min，94℃变性30s，52℃退火60s，74℃延伸30s，共30个循环，最后74℃延伸7min结束。第一轮PCR预计扩增片段长度约259bp。取第一轮PCR扩增产物1μl作模板，P3/P4各0.35μM，其余与第一轮相同，反应总体积为100μl。第二轮PCR预计扩增片段约157bp。每次PCR均设阳性及阴性对照。取第二次PCR扩增产物5μl在2%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭0.5mg/L）上100V电泳30min，置紫外灯下观察并拍照，通过与标准分子量PCR Marker（购自北京华美生物工程公司）作比较判断片段大小。PCR扩增在9600型DNA扩增仪上完成（美国PE公司）。
1.5 PCR产物的克隆和测序 随机选取5份阳性第二轮PCR产物，经纯化后克隆至T载体上，转化XL1-Blue感受态菌，用LB抗生素平板和蓝白菌斑筛选，提取阳性质粒，用PCR方法和酶切鉴定后，阳性标本送上海生工公司，采用荧光标记末端终止法，在ABI377型DNA自动分析仪上进行测序。
1.6 数据处理 不同人群TTV DNA检出率采用χ 2 检验;序列分析结果用BLAST、DNA Star软件进行同源性分析。
2 结果
2.1 不同人群TTV DNA PCR扩增结果 采用“套式”PCR法检测正常献血员、HBsAg阳性、抗-HCV阳性血清标本中TTV DNA，第二次PCR扩增片段约157bp，各组人群TTV DNA阳性率比较差异无显著性（P>0.05），见表1。
表1 不同人群TTV DNA的检出情况（略）
2.2 TTV DNA部分基因序列测定结果 纯化后的阳性PCR产物克隆至T载体，提取质粒进行测序。共测定5例阳性标本，从献血员分离到的TTV病毒株与日本株（AB008394） ［4］ 、中国株（TTV CH1） ［2］ 相对应位置基因变异不大，同源性均在97%以上。见表2。
表2 TTV分离株与日本株、中国株相应核酸序列的同源性比较（略）
3 讨论
TTV是日本学者在研究输血后不明原因的肝炎病人时发现的一种病毒 ［1］ 。研究显示TTV是一单链DNA病毒，无包膜，具有微小DNA病毒的某些特性。其基因组全长3739bp，有2个开放读码区（ORF） ［3］ ，ORF1位于589-2898核苷酸，编码770个氨基酸;ORF2位于107-712核苷酸，编码202个氨基酸。TTV病毒与输血后肝炎密切相关，日本的研究发现血液中的TTV浓度与ALT水平成正相关，并且肝组织中也分离到病毒基因 ［1，3］ ，显示TTV可能是输血后肝炎病原之一。我们采用“套式”PCR方法，对献血员进行TTV感染的检测，结果提示在湛江地区献血员人群中存在TTV的感染（10.94%）。
国外学者报道献血员人群中TTV的阳性率差异较大，从1.9%～12%不等 ［3，4］ ，国内也有报告在不同人群中检测到TTV DNA ［2，5］ 。日本对各型肝病患者、暴露于血及血制品的高危人群以及献血员血清进行了检测，结果显示出检出率较高（均在40%以上） ［3］ 。通过对检出率的分析，对其传播途径及致病性研究有一定的启示。英国的Tada K证实了TTV在母子间的传播 ［6］ ，献血员及正常人群中TTV的高携带率提示是否还有其它传播途径，尚有待进一步明确。
Naoumov等 ［7］ 在72例慢性肝炎患者中检出了18例TTV阳性（25%），与正常人群没有明显差别，而且在多种肝炎疾病中TTV DNA的阳性率也是相似的。另外，在绝大多数TTV DNA阳性肝炎病例中都没有明显肝损伤的生化或组织学证据，因而认为TTV可能与肝炎没有明显的关系。
Okamoto等 ［5］ 从献血员血清中分离出78株TTV，并进行了基因分型，分G1和G2两种基因型，型内又各分两个亚型，Miyakawa等 ［6］ 对日本多株TTV的序列进行了同源性分析，发现至少存在4个基因型和7个亚型。我们扩增的部分病毒基因片段来自TTV第一开放读码框架（OFR1），5例阳性标本测序分析结果与日本株、中国株的相应核苷酸序列同源性在97%以上，证明是同一病毒不同分离株。5例献血员TTV ORF1部分基因序列变异在1～7个核苷酸之间，可能属同一基因型。
TTV的研究仍处于初级阶段，目前还无法将TTV分离纯化，更无病毒学方面的研究。有关TTV的致病性各国报道不同，TTV是否是一种嗜肝病毒，TTV在输血后肝炎发病中的作用和地位如何等，尚未完全阐明。有必要进一步对TTV感染的人群，尤其对献血员人群进行调查，为输血后肝炎的防治提供参考依据。对于规范《献血法》，保障输血安全，保证国民经济的健康稳定发展，有着深远的社会和经济价值。
参考文献:
［1］Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，et al.A novel DNA virus（TTV）associ-ated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of un-known etiology［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，241（1）:92～97.
［2］周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因克隆及序列测定［J］.军事医学科学院院刊，1998，22（2）:107～109.
［3］Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，et al.Molecular cloning and characteriza-tion of a novel DNA virus（TTV）associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology［J］.Hepatol Res，1998，10（1）:1～16.
［4］ Simmonda P，Davidson F，Lycettet C et al.Detection of a nonel DNA virus（TTV）in blood donors and blood products［J］.Lancet，1998，352:191～195.
［5］温淑娟，黄镇华，程群，等.献血者中TTV检测及新基因型鉴定［J］.中国输血杂志，2000，13（3）:144～146.
［6］张天泰，周一鸣（综述）.输血传播病毒的研究进展［J］.国外医学病毒学分册，2000，7（2）:60～62.
［7］Naoumov N，Petrova E，Thomas M，et al.Presence of a newly described hu-man DNA virus（TTV）in patients with liver disease［J］.Lancet，1998，352:195～197.