氟喹诺酮类药物体外多步诱导人型支原体耐药的研究

【摘要】  　　目的 探讨氟喹诺酮类药物体外多步诱导人型支原体耐药的状况，指导临床合理用药。 方法 将Mh标准株和临床分离敏感株在体外进行四种氟喹诺酮类药物的多步诱导，然后检测其诱导前后对这四种药物的MIC变化。 结果 所有Mh敏感株经四种药物诱导后对诱导药物和非诱导药物均产生不同程度的耐药和交叉耐药，且这种体外获得性耐药具有较好的稳定性。 结论 体外长时间、低浓度的氟喹诺酮类药物刺激将诱导Mh产生耐药和交叉耐药，这对临床合理选用抗生素具有重要的指导意义。

【关键词】  人型支原体 氟喹诺酮 耐药性

　　Study on the drug  resistance of Mycoplasma hominis in vitro multiple step induced by fluoroquinolones.

　　YE Ping, DENG Chao-gan, WANG Hui, et al.

　　(Luohu District People’s Hospital of Shenzhen City, Shenzhen 518001, Guangdong, P. R. China)
   
　　Abstract：Objective  To explore the resistance of Mycoplasma hominis to fluoroquinolones in vitro for guiding reasonablly clinical application of antibiotics.  Methods  A Mycoplasma hominis standard strain and two clinical strains were induced stepwise with four kinds of fluoroquinolones, and minimum inhibition concentrations were detected before and after inducement.  Results  All Mh sensitive strains became resistant and cross-resistant to four kinds of inducing and non-inducing fluoroquinolones after induced.  Conclusion  The resistance and crossresistance of Mycoplasma hominis to fluoroquinolones can be induced after In vito long time and lower concentration stimulation with the fluoroquinolones. it helpful for guidance of reasonable choice of antibiotics in clinical practice.
   
　　Key words：Mycoplasma hominis(Mh); Fluoroquinolones;  Drug resistance

　　人型支原体(Mh)是泌尿生殖道感染的常见病原体，氟喹诺酮类药物作为治疗支原体感染的主要药物，一直以来对支原体保持着较强的敏感性。但近年来，随着氟喹诺酮类药物的广泛应用，其耐药性问题日益突出。现将Mh标准株和临床分离敏感株在体外进行多种氟喹诺酮类药物的多步诱导研究，检测其耐药性和交叉耐药性的发生情况，为临床合理选用抗生素治疗提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验药物  环丙沙星(CFX)、氧氟沙星(OFX)、司帕沙星(SPX)和加替沙星(GAT)4种药物的粉剂均由中国科学院上海药物研究所提供。所有药物均用二甲基甲酰胺(DMF)与乙醇溶解后，用灭菌蒸溜水配成1 024mg/L的母液作为储备液，-70℃冰箱保存备用。使用时再以相应液体培养基稀释成所需的浓度。

　　1.1.2  菌株来源  Mh标准菌株PG21购于首都儿科研究所；临床敏感株收集自2005年7月～2006年10月间来皮肤性病科就诊的非淋菌性尿道炎(NGU)的患者，采用肉汤稀释法筛选对氟喹诺酮敏感的Mh株，经菌落形态、底物分解、pH值、生长速度等初步鉴定［1］，液体传3代后，-70℃保存备用。

　　1.1.3  试验菌液  将Mh冷冻培养物，在室温下融化，用相应液体培养基1:100稀释，37℃培养24～48h后，以108-10颜色变化单位(color changing unit,CCU)/0.1ml作为接种物。

　　1.1.4  培养基  按文献［1］的方法配制。

　　1.2  方法

　　1.2.1  药物敏感试验  采用肉汤稀释法，参照文献［1］的方法进行。

　　1.2.2  诱导耐药试验  将Mh标准菌株和临床敏感株分别接种到固体培养基中,在95%N2、5%CO2条件下培养48～96h后，在低倍镜下挑取单个菌落在液体培养基中增菌，测定MIC。将Mh标准株和临床敏感株分别在含1/2MIC的CFX、OFX、SPX、GAT的液体培养基中传代，每隔1～2d转种1次，12代后转无药物的固体培养基中，挑单个菌落在液体培养基中培养后测MIC，如药物诱导后MIC≥4倍诱导前MIC为耐药［2］。并设在不含药物的液体培养基中培养12代作对照。

　　1.2.3  交叉耐药试验  将诱导后的耐药株在液体培养基中培养后测定对非诱导药物的MIC，并比较诱导前后其MIC的变化。若药物诱导后菌株对非诱导药物的MIC≥4倍诱导前MIC则为交叉耐药。

　　1.2.4  稳定耐药试验  将诱导后的耐药株在无药物液体培养基中培养，每1～2d转种1次，12代后测定MIC，以判断耐药的稳定性。

　　2  结果

　　2.1  诱导耐药结果  Mh敏感株经四种药物诱导后对所诱导的药物均产生耐药（对诱导药物的MIC诱导后≥4MIC诱导前）。见表1。

　　2.2  交叉耐药结果  Mh敏感株经四种药物诱导后对非诱导的药物均产生不同程度的交叉耐药（对非诱导药物的MIC诱导后≥4MIC诱导前）。见表1。

　　表1  体外药物诱导前后Mh对四种药物的MIC(mg/L)（略）

　　3  讨论
   
　　氟喹诺酮类药物是近二十年来迅速发展起来的一种化学合成广谱抗生素，其主要作用机制是通过抑制细菌或支原体拓扑异构酶，阻碍其DNA的复制、修复和转录等功能而达到杀菌的目的。由于抗生素的滥用、不规则治疗、混合感染、反复感染及慢性迁延等原因，使得Mh对氟喹诺酮类药物的耐药性问题日益突出，也迫使人们在氟喹诺酮类药物的耐药性方面进行一系列的研究和探索。
   
　　早在1997年，Bebear等［3］就对人型支原体标准株PG21进行了多种氟喹诺酮类药物的体外诱导试验，结果发现：诱导后的菌株产生明显的耐药性和交叉耐药性。他们进一步的研究［4］显示：一步、二步诱导仅产生低度耐药；而多步诱导才产生高度耐药。而张冉等［5］也对Mh标准菌株PG21和多株临床敏感株进行多种氟喹诺酮类药物的体外诱导试验，研究结果也证实了这一点，但也发现,经司帕沙星诱导后Mh对SPF产生耐药，而对其它氟喹诺酮类药物无交叉耐药。最近，对莫西沙星、加替沙星等新一代的喹诺酮类药物体外诱导Mh标准菌株PG21的研究［6］，也说明新一代强效的喹诺酮类药物同样能诱导人型支原体产生耐药和初步诱导产生低水平耐药，多步诱导产生高水平耐药。
   
　　本研究中，我们对Mh标准菌株PG21和临床敏感株进行多种氟喹诺酮类药物的体外诱导试验，并检测其诱导前后的MIC变化及其交叉耐药和稳定耐药的情况。结果发现,经药物诱导后的菌株，不仅对所诱导的药物，而且对非诱导药物的MIC均有4倍以上的提高。说明氟喹诺酮类药物，不论是老一代的环丙沙星、氧氟沙星，还是新一代的司帕沙星、加替沙星均能在体外诱导人型支原体敏感株产生耐药性和交叉耐药。与张冉等［5］研究结果不同的是，经司帕沙星诱导后Mh不仅对SPF耐药，对其它氟喹诺酮类药物也呈现交叉耐药。同时，稳定耐药实验也证实了这种体外诱导获得的耐药性具有较好的稳定性。体外诱导耐药实验揭示了抗生素的长期、不规则应用将诱导Mh产生耐药，即便是新一代强效的抗生素如司帕沙星、加替沙星也不可避免。因此，在支原体感染临床治疗过程中，应尽量短疗程、足量使用这类药物，避免支原体受到低浓度药物的长期刺激，使原来优势敏感菌被抑制和杀灭，诱导、筛选出相应的耐药菌株，造成人为的“抗生素筛选”，从而导致临床的难治甚至治疗失败。另外，由于氟喹诺酮类药物之间存在交叉耐药，因此，若一种氟喹诺酮类药物治疗无效，应更换其它类的抗生素，以免造成再次治疗失败。同时，由于这种获得性耐药具有较好的稳定性，因此，这也提醒在临床治疗过程中，一旦出现了氟喹诺酮类耐药，往往需要一个较长的时间复敏，至少在短期内不要再选用这类抗生素，否则将导致临床治疗失败。
   
　　本研究揭示了氟喹诺酮类药物的不规则使用是造成其耐药及交叉耐药的重要原因。至于引起人型支原体氟喹诺酮耐药的更进一步的机制，目前研究［7］认为与人型支原体DNA螺旋酶和拓扑异构酶IV有关，而这两种酶分别由GyrA、GyrB和ParC、ParE这两组基因编码。这两组编码基因的变异将导致人型支原体对氟喹诺酮类耐药性的发生［6～8］。至于人型支原体氟喹诺酮耐药的分子机制，将是我们下一步的研究目标。
   
　　总之，正确认识氟喹诺酮类药物耐药性的发生机制，对临床治疗中抗生素的合理选用，减少耐药性的发生，对有效控制支原体感染具有重要的指导意义。

【参考文献】
  　　［1］ 吴移谋, 余敏君, 尹卫国,等.从临床标本中定量检测泌尿生殖道支原体耐药性的研究［J］. 中华检验医学杂志,1998,21(6):335.

　　［2］ Michea-Hamzehpour M,Kahr A,Pechere JC. In vitro stepwise selection of resistance to quinolones,β-lactams and amikacin in nosocomial Gram-negative bacilli［J］. Infection,1994,2:105.

　　［3］ Bebear CM,Bove JM,Bebear C,et al.Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones［J］. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(2):269～273.

　　［4］ Bebear CM,Renaudin H,Charron A,et al.Alterations in topoisomerase IV and DNA gyrase in quinolone-resistant mutants of mycoplasma hominis obtained in vitro［J］. Antimicrob Agents Chemother,1998,42(9):2304～2311.

　　［5］ 张冉,吴移谋,向斌,等.次抑菌浓度的喹诺酮类药物诱导人型支原体耐药与交叉耐药的研究［J］.实用预防医学,2000,7(1):12～14.

　　［6］ Gruson D,Pereyre S,Renaudin H,et al.In vitro development of resistance to six and four fluoroquinolones in mycoplasma pneumoniae and mycoplasma hominis,respectively［J］. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(3):1190～1193.

　　［7］ 叶萍,王晓川,吴志华. 人型支原体氟喹诺酮耐药性的分子机制［J］.中国麻风皮肤病杂志,2005,21(10):805～807.

　　［8］ Pereyre S, Renaudin H,Bebear C,et al. In vitro activities of the newer quinolones garenoxacin,gatifloxacin,and gemifloxacin against human mycoplasmas［J］. Antimicrob Agents Chemother,2004,48:3165～3168.

作者单位：深圳市罗湖区人民医院皮肤科,广东 深圳 518001; 深圳市龙岗中心医院,广东 深圳 518116.