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【摘要】 目的 探讨白血病患者Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞亚群极化改变的临床意义。 方法 采用流式细胞仪检测39例白血病患者发病时外周血CD3+CD8-、CD3+CD8+细胞内IFN-γ和IL-4水平，并与同期30例对照组比较。 结果 白血病患者Th、Tc细胞内IFN-γ较对照组显著降低（P<0.01），而IL-4升高（P<0.05），Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞比值显著降低（P<0.01）。 结论 白血病的发病可能与Th1/Th2失调有关。
【关键词】 白血病 T淋巴细胞亚群 γ-干扰素 白介素-4
Expression of IFN-γ and IL-4 in T helper cells and T cytotoxic cells in leukemia patients.
YOU Wei-wen, DU Xin, ZHANG Qiong-li, et al.
(Department of Hematology, Shenzhen Municipal Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong, P. R， China)
Abstract：Objective To analyze the polarization of T helper cells and T cytotoxic cells in leukemia. Methods There 39 patients with leukemia pretreatment and 30 healthy controls were detected for intracellular factors(IFN-γ、IL-4) in CD3+CD8- and CD3+CD8+ cells by flow cytometry. The results were compared. Results Compared with healthy controls, in the patients with leukemia, the percent of IFN-γsecreting Th cells(Th1) and Tc cells(Tc1) decreased significantly (P<0.01), the percent of IFN-γsecreting Th cells(Th2) and Tc cells(Tc2) increase (P<0.05), and the radio of Th1/Th2、Tc1/Tc2 cells decreased significantly (P<0.01). Conclusion It suggests that a predominant Th2、Tc2 cytokine profile occurs in the patients with leukemia. The study of the balance of Th1/Th2、Tc1/Tc2-cytokines expression may be useful as potential disease progression in the patients.
Key words：Leukemia; Tlymphocyte subsets; Interferon-alpha; Interleukin-4
人类CD4+T淋巴细胞根据分泌细胞因子和作用功能的不同可分为Th1、Th2两种类型，Th1细胞分泌的细胞因子称为I型细胞因子，主要包括IL-2、IL-12、IFN-γ等，Th2细胞分泌的细胞因子称为II型细胞因子，主要包括IL-4、IL-5、IL-10等，同样地，CD8+T细胞也可分为Tc1、Tc2两种类型，分泌I型细胞因子的为Tc1，分泌II型细胞因子的为Tc2细胞。白血病是造血干细胞克隆性恶性疾病，T细胞免疫作为抗肿瘤免疫有效的重要环节，在白血病发生、发展过程中起重要作用［1,2］。Th1/Th2类细胞和Tc1/Tc2类细胞作为Th、Tc细胞的功能亚群，其细胞功能主要通过合成分泌的细胞因子发挥作用，目前尚未发现特异性表面抗原以区分Th1/Th2、Tc1/Tc2类细胞，我们根据Th、Tc细胞因子表达的非随意性，分别以产生IFN-γ、IL-4的CD3+CD8-、CD3+CD8+T细胞代表Th1、Th2 及Tc1、Tc2细胞［3,4］，通过流式细胞仪检测患者外周血CD3+CD8-和CD3+CD8+细胞内细胞因子IFN-γ，IL-4水平，进一步探讨Th1/Th2、Tc1/Tc2功能极化改变在白血病免疫逃逸的机制。
1 资料与方法
1.1 临床资料 收集自2005年9月～2006年10月在深圳市第二人民医院血液科确诊的白血病患者39例，其中男22例，女17例，年龄（31.81±11.9）岁，其中急性非淋巴细胞白血病26例，急性B淋巴细胞白血病8例，慢性粒细胞性白血病（慢性期）5例，其诊断判定符合《血液病诊断及疗效标准》［5］，对照组取30例健康成人，男19例，女11例，年龄15～51（28.37±8.76）岁，血常规、肝功能等项目检查均在正常范围内。
1.2 试剂与仪器 佛波酯乙醇（PMA）、离子霉素（Ionomycin）、莫能霉素（Monensin）均为Sigma公司产品，四色单抗CD3-TC、CD8-ECD、IL-4-PE、IFN-γ-FITC及PE、FITC标记同型鼠IgG单抗为Caltag Laboratories 产品，细胞固定、破膜剂为An Der Grub公司产品，RPMI medium 1640为Gibco Laboratories生物技术公司产品。流式细胞仪为Beckman coulter公司Epics XL型。
1.3 单个核细胞内细胞因子方法的检测 无菌采集肝素抗凝静脉血100μl，加100μl RPMI1640液，然后依次加入0.1μg／ml佛波酯乙醇12μl，1μg/ml离子霉素4μl，1mg／ml莫能霉素 3.4μl。在37℃、5％ CO2环境下培养4h，将样本平均分为A、B两管，各加入抗CD3,CD8单抗，在377℃避光孵育15min，加固定剂A 200μl、37℃避光孵育15min，加PBS 3ml震荡、1 200r／min离心5min，弃上清液，然后A管加破膜剂B 100μl，抗IFN-γ，IL-4单抗，B管加破膜剂B 100μl，同型对照IgG单抗，37℃避光孵育15min，PBS液洗涤、离心、弃上清液，最后以PBS液悬浮细胞，以流式细胞仪检测。
1.4 统计学处理 数据用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验经SAS8.22软件分析。
2 结果
与正常对照组比较，白血病患者外周血Th1、Tc1细胞百分率明显减低（P＜0.01），Th1、Tc2细胞百分率增高（P＜0.05），Th1/Th2、Tc1/Tc2比值显著下降（P＜0.01），见表1。
表1 白血病患者及正常对照组外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞的检测（略）
Note：与对照组比较:△P＜0.05,△△P＜0.01;*为Th1与Th2、Tc1与Tc2比值。
3 讨论
在机体抗肿瘤免疫反应中，细胞免疫是主要的抗肿瘤方式，研究显示，Th1细胞通过直接杀瘤或分泌Th1细胞因子激活NK、CTL的抗肿瘤活性，其中IFN-γ和TNF-α是抗肿瘤免疫重要作用因子，能增强MHC I类抗原在肿瘤细胞的表达，增强CTL的抗肿瘤作用，而Th2类细胞因子合成、分泌的增高则有利于癌变细胞逃避免疫监视。同时，Th1类细胞向Th2类细胞漂移会严重干扰机体的抗肿瘤免疫，而且与肿瘤的恶性度呈正相关，目前其机制尚未完全明确，故深入探讨Th1/Th2、Tc1/Tc2类细胞平衡队研究包括白血病在内的恶性肿瘤疾病有重要意义。
白血病作为血液系统的恶性疾病，系造血干细胞或祖细胞突变引起的造血系统恶性肿瘤，越来越多的资料显示，细胞免疫在白血病发病过程中起着重要作用。本实验通过流式细胞仪检测患者外周血T细胞，分别以CD3+CD8-T细胞和CD3+CD8+T细胞代表Th、Tc细胞，以胞内I、II型细胞因子IFN-γ、IL-4区分Th1、Tc1类和Th2、Tc2类细胞。结果显示白血病患者外周血Th1、Tc1细胞百分率显著减低，提示患者机体抗肿瘤细胞免疫功能下降，Th2、Tc2细胞百分率升高，Th1类/Th2类细胞及Tc1类/Tc2类细胞比例升高，显示患者体内出现Th1向Th2、Tc1向Tc2漂移，呈现Th2优势表达，提示发生肿瘤免疫监视逃逸可能性增大，这一结论与Yothda P［6］报道一致，由于Th、Tc细胞分泌的I、II型细胞因子对Th、Tc细胞具有负反馈作用，如I型细胞因子IL-12等可抑制Th2细胞的分化及分泌II型细胞因子，而IL-4、IL-10等II型细胞因子则促使Th0向Th2转化，同时抑制Th1分化增殖［7,8］，形成恶性循环，这可能是白血病细胞逃避、对抗肿瘤免疫的机制之一。至于白血病细胞有无可能通过自分泌加重Th、Tc细胞功能极化异常仍需进一步研究探讨，通过对白血病患者Th1/Th2、Tc1/Tc2功能极化的研究，不仅有助于阐明疾病的发生机制，而且有可能为疾病的治疗提供新的方法，即促使白血病细胞或机体免疫由Th2向Th1型逆转，增强机体抗肿瘤细胞免疫，达到白血病治疗目的。
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作者单位：深圳市第二人民医院血液科，广东 深圳 518035； 深圳市血液病研究所，广东 深圳 518035.