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【摘要】 目的 探讨还原型谷胱甘肽（GSH）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺内合成的分子机制及其作用。 方法 健康雄性Wistar大鼠14只，随机分COPD模型组和对照组，每组7只。采用每日熏香烟和两次气管内滴入200μg脂多糖法制作COPD大鼠模型，检测肺内GSH和活性氧（ROS）浓度、总抗氧化力水平（T-AOC）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性；对相关指标作相关分析。 结果 COPD组大鼠肺内GSH（35.86±6.01)mg/mg·prot和ROS（30.45±5.23)U/mg·prot增高，T-AOC（0.69±0.10)U/mg·prot降低，γ-GCS活性（2.06±0.15)U增高，与对照组分别为(16.50±2.43)mg/mg·prot、（9.84±2.16）U/mg·prot、(1.59±0.57)U/mg·prot和(1.12±0.09)U相比差异具有显著性（P均<0.05）;GSH、ROS、γ-GCS活性与PEF、FVE0.3、PaO2呈直线负相关，与PaCO2呈直线正相关；T-AOC与PEF，FVE0.3呈直线正相关（P均<0.05）。 结论 COPD大鼠肺内存在氧化/抗氧化失衡，其局部抗氧化作用是通过激活γ-GCS活性，增加GSH合成来发挥局部抗氧化作用，其气道阻力增加可能与肺内局部氧化/抗氧化失衡有关。
【关键词】 谷胱甘肽（GSH） γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS） 肺疾病 阻塞性 抗氧化
Synthetic mechanism and effect of glutathione in lung of rats with chronic obstructive pulmonary disease.
LIN Shu-dian, ZHOU Qiao-ling, DAI Ai-guo.
(Department of Nephrology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, 410078, Hunan, P.R.China; Department of Respiratory Disease Research, Hunan Institute of Gerontology, Hunan Geriatric Hospital, Changsha 410001, Guangxi, P. R. China)
Abstract：Objective To elucidate molecular mechanism and effect of glutathione in lung of rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Methods Fourteen male Wistar rats were randomly divided into COPD model group and control groups each consisted of 7 rats. The COPD model was established by twice intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS) and exposure to cigarette smoke daily. The levels of reduced glutathione (GSH), reactive oxygen species (ROS), total antioxidative capacity (T-AOC) and the activity ofγ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS) in lung tissue were determined. Results (1) The levels of the GSH, ROS, and the activity of γ-GCS were 35.86±6.01mg/mg·prot, 30.45±5.23U/mg·prot and 2.06±0.15 U significantly, increased. The level of T-AOC was 0.69±0.10U/mg·prot） significantly lower in the COPD group as compared to that in the control group （16.50±2.43mg/mg·prot，9.84±2.16U/mg·prot，1.59±0.57U/mg·prot and 1.12±0.09U, respectively, P<0.05）. (2) The levels of GSH, ROS and γ-GCS activity showed a linear negative correlation with PEF, FVE0.3 and PaO2 in lung of rats with COPD, and a positive correlation with PaCO2. The level of T-AOC was positively correlated with PEF，FVE0.3（P<0.05） Conclusion There is oxidative/antioxidative imbalance in lung of rats with COPD, GSH plays a key role in antioxidation in the local lung tissue and the increased activity of γ-GCS is associated with sythesis of GSH and the enhancement of the effects of antioxidation.
Key words：Glutathione (GSH); γ-glutamylcysteine synthetase (GCS); Pulmonary disease; Antioxidation
吸烟是慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要致病因素，烟雾中含有高浓度的自由基和氧化剂，加之吸烟者肺部汇聚的炎症细胞释放氧自由基加重氧化负担，导致氧化/抗氧化失衡，对呼吸道上皮细胞、肺基质有直接损伤，并影响弹性蛋白合成和修复，最终导致肺气肿的发生、发展及恶化。因此，氧化/抗氧化失衡参与COPD发病病理全过程，是COPD主要发病机制之一。 我们既往在大鼠及人体肺组织中的研究发现［1,2］，谷胱苷肽（GSH）生物合成限速酶――γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）蛋白及其mRNA在COPD肺组织支气管，肺泡和炎症细胞中高表达，并可能受AP-1，NF-κB转录调控。γ-GCS催化的终产物GSH是细胞内普遍存在的三肽抗氧化剂，对抗氧化应激、维持细胞内氧化还原状态稳定，解除病理状态下蛋白质二巯键的形成，灭活ROS，合成DNA前体等均有重要意义。
1 材料与方法
1.1 动物模型与分组 健康雄性Wistar大鼠（中南大学湘雅医学院动物部提供）14只，体重(200±20)g，随机分COPD组和对照组，每组7只。用每日熏香烟及两次气管内滴入200μg脂多糖法制作COPD大鼠动物模型［3］。对照组不作任何干预，饲养条件同COPD组。
1.2 肺功能及血气测定 COPD组大鼠末日熏吸香烟后，与对照组一起用1％戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台，气管切开插入Y形气管插管。Y形气管插管两端分别与流速、压力传感器连接，流速传感器对应端与动物呼吸器相连接。设置潮气量10ml/kg，呼吸频率60次/min。将压力、流速传感器分别与Maclab数据记录分析系统连接。外加25cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)的压力，迫使动物深吸气，再以25cmH2O的负压吸引，造成深呼气，较准确测出呼气峰流速（PEF）和0.3秒用力呼气量（FEV0.3）［3］。而后（2h内）颈动脉采血检测PaO2和PaCO2，放血处死。
1.3 组织标本提取 剖胸取右上肺叶于4％多聚甲醛（含1‰焦碳酸二已脂）（武汉博士德生物工程有限公司）中固定，常规石蜡包埋，切片行HE染色。取余肺置液氮中速冻，用于GSH、ROS、T-AOC和γ-GCS活性测定。
1.4 肺组织中GSH、ROS、T-AOC和γ-GCS活性检测 GSH、ROS、T-AOC测定按试剂盒说明操作（南京建成生物工程研究所）。γ-GCS活性测量参考文献中经典方法(双酶法)［4］，即在终体积为1ml的反应体系中340nm处观测吸光度值的变化。通过NAD+形成的速率代表γ-GCS活性（单位U）。以双缩脲法进行蛋白定量（南京建成生物工程研究所）。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10.0统计软件进行组间t检验，对相关指标作相关分析。P＜0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 肺功能及血气测定 本实验采用每日熏香烟和两次气管内滴入200μg LPS法制作COPD大鼠模型。COPD组大鼠出现每分钟通气量（MVV）、PEF、FVE0.3和PaO2较对照组降低，PaCO2较对照组增高，说明COPD组大鼠小气道阻力增加，CO2潴留，肺通气功能障碍(表1)。
表1 两组大鼠肺功能及血气分析比较（略）
注:与对照组比较,P＜0.05。
2.2 病理组织学结果 COPD组大鼠肺组织外观体积较大，膨胀，灰白色，表面无出血及渗液。光镜下可见COPD组细支气管及周围炎症细胞浸润，气管上皮细胞纤毛倒伏、脱落，杯状细胞化生明显，管腔中炎症细胞及黏液增多，有黏液栓形成，管腔变小、狭窄，管壁周围平滑肌和纤维细胞增生。肺泡扩张，间隔变薄、断裂，融合形成大的气腔。小动脉血管壁增厚，平滑肌增生，管腔变小，周围炎性细胞浸润。对照组各级支气管上皮细胞完整，纤毛排列整齐，未见炎症细胞浸润，管腔中有少许粘液；肺泡间隔完整，血管壁无增厚。
2.3 肺组织中GSH、ROS、T-AOC和γ-GCS活性 GSH在COPD组中较对照组有两倍提高，而ROS提高更为显著， T-AOC下降明显，与对照组相比差异显著（P<0.05），表明提高的GSH不足以抵抗ROS的增高，肺中存在氧化/抗氧化失衡。COPD组γ-GCS活性较对照组明显增高（P<0.05），提示GSH的增高是通过γ-GCS活性增高以实现,见表2。
表2 两组大鼠肺内GSH、ROS、T-AOC和γ-GCS 活性变化（略）
注:与对照组比较,P<0.05。
2.4 肺组织中GSH、ROS、T-AOC、γ-GCS活性和MVV、PEF、FVE0.3、PaO2、PaCO2之间的相关性分析 相关分析表明，GSH、ROS、γ-GCS活性与PEF、FVE0.3、PaO2呈直线负相关，与PaCO2呈直线正相关；T-AOC与PEF、FVE0.3呈直线正相关，与PaCO2呈直线负相关（P＜0.05），提示肺组织氧化/抗氧化失衡，可能是导致气道阻力增加的重要因素，见表3。
表3 肺内ROS、GSH、T-AOC、γ-GCS活性和MVV、PEF、FVE0.3、PaO2、PaCO2之间的相关性分析（略）
3 讨论
吸烟是COPD的首要致病因素，烟雾中含有大量的化学物质，其中包含高浓度的自由基和氧化剂，这些成分不仅直接损害肺机质（如弹性蛋白和胶原），而且干扰弹性蛋白的合成和修复，加大对肺机质的蛋白水解损伤，导致肺气肿的发生。研究发现，肺局部存在氧化应激是肺组织发生一系列病理改变的始动因素。GSH是肺细胞内广泛存在的三肽抗氧化剂，在肺组织中主要分布于气道内衬液中，作为抵御外源吸入性氧化剂的第一道防线。Rahman［5,6］等发现，吸烟引起肺中性粒细胞大量浸润和上皮细胞渗漏性增加，均与氧化应激有关，其机制是气道内衬液中抗氧化剂GSH被消耗减少，由氧化损伤所致。因此，GSH在维护肺上皮细胞完整和正常功能，抵御氧化损害中发挥关键作用。
本实验发现，COPD组大鼠肺内GSH较对照组有两倍提高，而ROS水平升高更为显著，且抗氧化力下降，表明在COPD中虽然GSH有两倍提高，但抗氧化能力却降低，不足以抗氧化损伤，以致疾病继续发展恶化。这一结果与Morrison等［6］的研究一致。Ruaznak等［7］在人支气管上皮细胞中发现，吸烟者（肺功能正常或伴COPD）细胞内GSH较健康非吸烟者显著增高，但烟雾提取物（CSE）培养的细胞中GSH水平均低。Tager等［8］用流式细胞仪检测支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞GSH水平，发现吸烟伴/不伴COPD者GSH水平明显降低，并且于患者FEV1和PaO2降低密切相关。以上试验结果在不同细胞中GSH 水平不一致，其机制尚未阐明。一般认为，氧化应激起初阶段消耗组织细胞中GSH，随后由于GSH反馈调节和氧化应激诱导γ-GCS基因表达，增加其合成和活化，导致GSH 水平增高，以适应持续的氧化状态。本实验室的实验发现，氧化－还原敏感因子AP-1和NF-κB可能参与γ-GCS mRNA的表达与调控［1］。其机制可能是，氧化应激（烟雾）刺激下，细胞产生ROS，由此改变胞浆中氧化－还原平衡状态，形成有利于AP-1和NF-κB核转位的氧化环境，随后AP-1和NF-κB与γ-GCS基因启动子相应部位结合，启动γ-GCS mRNA转录，γ-GCS合成增加，催化GSH合成增多，参与抗氧化过程。总之，在体和细胞实验表明，烟雾诱导的氧化应激均可引起组织或细胞中抗氧化力的下降，是导致COPD继续发展的重要原因之一。GSH在生物体内分两步合成，由两个酶催化，其中γ-GCS是合成中的限速酶。本研究显示，γ-GCS在COPD组活性增高，提示GSH增高是由γ-GCS活性增高以实现的。
相关分析发现，肺内氧化/抗氧化状态与气道阻力密切相关，结合以往的研究结果［2］,我们认为肺内氧化/抗氧化失衡可能是直接导致气道阻力增加的主要因素之一。本实验表明，COPD大鼠肺内存在氧化/抗氧化失衡，并由此产生的氧化应激激活γ-GCS活性，从而提高肺组织中GSH水平。而氧化应激诱导产生的ROS大大超过GSH抗氧化水平，以致肺总抗氧化力降低，由此导致气道阻力增加，疾病最终逐渐发展、恶化。
【参考文献】
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［6］ Morrison D, Rahman I, Lannan S, et al. Epithelial permeability, inflammation, and oxidant status in the air spaces of chronic smokers［J］. Am J Respir Crit Care Med, 1999,159:473～479.
［7］ Rusznak C, Mills PR, Devalia JL, et al. Effect of cigarette smokes release from cultured human chronic obstructive pulmonary disease［J］. Am J Respire Cell Mol Biol, 2000,23:530～536.
［8］ Tager M, Piecyk A, Kohnlein T, et al. Evidence of a defective thiol status of alveolar macrophages from COPD patients smokers［J］. Free Radic Biol Med, 2000,29:1160～1165.
作者单位：中南大学湘雅医院肾脏病科 湖南 长沙 410078；湖南省老年医院－湖南省老年医学研究所呼吸病研究室,湖南 长沙 410001.