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【摘要】 目的 探索侵袭内阿米巴较好的培养和保种方法。 方法 分别应用三种常用的双相培养基对侵袭内阿米巴进行培养和保种的效果比较。 结果 侵袭内阿米巴在营养琼脂血清盐水培养基中与其它两种培养基比较能更好地生长和增殖。 结论 营养琼脂血清盐水培养基制备方法简便，可较好地用于侵袭内阿米巴的培养和保种。
【关键词】 侵袭内阿米巴 培养 保种
Comparison of methods for culture and preservation of Entamoeba invadens.
LI Shao-fen, LI Ai-qun, QIN Qiu-sha, et al.
（Department of Parasitoloy, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182, Guangdong, P.R. China）
Abstract：Objective To look for a better methods for culture and preservation of Entamoeba invadens. Methods Three kinds of two phase culture mediums were applied to the culture and preservation of Entamoeba invadens and their effects in proliferation of the protozoan were observed. Results According to ability of growth and proliferation of Entamoeba invadens, nutrient agar culture medium containing Ringer’s liquor and blood serun is the best among the three kinds of culture mediums. Conclusion Nutrient agar culture medium containing Ringer’s liquor and blood serum has a better effect used in the culture and preservation of Entamoeba invadens.
Key words：Entamoeba invadens；Culture；Preservation
侵袭内阿米是人类重要致病原虫的代表之一，也是医学教学和研究的重要目标。随着国家发展所带来的民众身体素质普遍提高和营养状况的改善，以及环境卫生和个人卫生情况的改良。在我国大多数地区，特别是在城市，表现阿米巴痢疾等严重症状的阿米巴病人越来越少见。加之溶组织内阿米巴滋养体抵抗力低，在外界环境中极易死亡，这些都为获得溶组织内阿米巴虫体进行教学和研究带来了很大的困难。因此，用侵袭内阿米巴（Entamoeba invadens）代替溶组织内阿米巴用于科研特别是教学有其实际应用价值。本文用三种培养方法对该阿米巴的培养和保种效果进行了探索和比较，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 侵袭内阿米巴虫种原液由中山医学院病原生物学教研室提供；营养琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司生产；注射用青霉素钠为广州白云山天心制药股份有限公司产品（060111）；注射用硫酸链霉素为深圳南方制药有限公司产品（N050104）；其余培养所用试剂均为分析纯；滤菌器（PALL-Gelman Laboratory），实验仪器由广州医学院病原生物学教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 LES培养（A培养基） 参照陈佩惠等［1］描述的方法进行配制,用1M的NaOH将pH值调至7.2左右。固相和液相部分均采用洛克氏（Locke）液，培养基分装于1.5cm×15cm玻璃试管中，高压消毒（15磅20min）后，放置4℃冰箱备用。
1.2.2 营养琼脂血清盐水培养基（B培养基） 下层固相斜面由营养琼脂粉（蛋白胨10g、牛肉浸出粉3.0g、NaCl 5.0g、琼脂粉20g）23g加蒸馏水1 000ml溶化后制备,用1M的NaOH将pH值调至7.2左右。上层液相参照陈佩惠等［1］描述的方法进行配制。
1.2.3 琼脂蛋白胨双相培养基（C培养基） 下层固相斜面制备方法与B培养基相同；上层液相按照陈佩惠等［1］描述的方法进行制备,然后用1M的NaOH将pH值调至7.2左右，但培养所使用的血清为人血清。
1.2.4 消毒米粉的制备 取粳米约30g，加入蒸馏水浸没，浸泡过夜后，弃去剩余水分，将米置于37℃温箱中烘干后,用研钵反复研磨，然后将米粉置于65℃烤箱中彻底干燥，用孔径0.15mm的铜药筛过筛，经显微镜下观察米粉颗粒大小基本达到适合阿米巴吞噬（约10μｍ）后，收集分装于青霉素小瓶中,高压灭菌（15磅20min）后，置于65℃烤箱中烘烤备用。使用时在每支培养管的液相加入消毒米粉约0.05ｇ。
1.2.5 血清采备 采集正常人血置4℃冰箱内，24h后，用无菌吸管吸取血清，血清用无菌的滤菌器过滤分装，然后经56℃ 30min灭能，存储于-20℃冰箱备用。
1.2.6 培养用青、链霉素制备 将注射用青、链霉素分别配成20万Ｕ/ml，各取等量的两种抗生素混匀，使其终浓度均为10万Ｕ/ml。使用时,每支培养管每次只要加上述两种抗生素混合液1～2滴（约5 000Ｕ）。
1.2.7 培养与保种方法 将上述配制好的双相培养基加入青、链霉素后置37℃的恒温箱培养24h，证明澄清无菌后即可使用。充分混匀侵袭内阿米巴虫种原液（或保种液），每管培养基分别加入3滴，然后再加入一定量的消毒米粉，在27℃的恒温培养箱中培养。培养基每3d转种1次，方法为把相同培养基的上层液相混合；分别从三种培养基的混合液相中吸取0.5ml至一支灭菌的试管中混匀；然后每支新配制的培养管加入2滴该阿米巴培养液，再加入消毒米粉，在27℃的恒温培养箱中培养。把相同培养基的上层液相混合到一支培养管中，随即保存于4℃冰箱中。
1.2.8 虫体的观察 将上述三种培养基在接种侵袭内阿米巴培养后的第24h、48h、72h（如果未见虫体可延长至96h）取培养基的上层液相于血球计数板上进行虫体计数。方法为吸取培养液沿培养基斜面稍作冲动，吸底部培养液，从盖玻片与载玻片交界的部位将培养的虫体悬液滴入细胞计数池中，使悬液自由充满盖玻片下方间隙，光学显微镜下计数血球板中四大格内的虫体。虫体数（虫体/mm）=（四大格中的虫体数/4）×10000。虫体计数重复4次，取平均值。在侵袭内阿米巴培养的中后期由于开始有较多的包囊形成，因此对滋养体和包囊分别计数;阿米巴活动情况判定为从侵袭内阿米巴滋养体伪足的形成速度和单位时间内的移动距离初步判断其活动能力。“+”指活动能力一般；“++”指运动活泼；“+++”指运动非常活泼。
2 结果
2.1 冷藏9d的阿米巴复苏培养结果 将侵袭内阿米巴虫种原液在4℃冰箱保存9d后分别接种A、B和C培养基。培养的1～2d培养基中均未查见阿米巴滋养体；在72h始发现少量滋养体；接种培养约96h后可查见较多的滋养体，3种培养基滋养体数目分别为5.34×104、35.90×104和22.17×104。
2.2 新鲜阿米巴培养物转种培养结果 将2.1培养的阿米巴混合后转种A、B、C 3种培养基的培养结果见表1。
表1 .新鲜阿米巴培养物转种三种培养基培养结果的比较（略）
2.3 培养物转种培养后的第1次重复结果 将2.2培养72h的新鲜阿米巴混合后转种A、B、C 3种培养基，结果见表2。
2.4 培养物转种培养后的第2次重复结果 将2.3培养72h的新鲜阿米巴混合后转种A、B、C 3种培养基，结果见表2。
2.5 冷藏3d的阿米巴复苏培养结果 将2.1培养的阿米巴在4℃冰箱保存3d,然后分别接种3种培养基的培养结果见表3。
表2 新鲜阿米巴培养物转种三种培养基培养结果的重复（略）
表3 保种3d的阿米巴复苏培养结果的比较（略）
2.6 保种1个月和2个月的阿米巴复苏培养结果 将2.1培养的阿米巴同种培养基混合后在4℃冰箱分别保存30d和60d，然后同种培养基保种液接种同种新鲜的培养基，观察三种培养基的保种效果。保存30d虫体的A、B和C 3种培养基培养滋养体数目24h分别为9.38×104、15.67×104和6.06×104；48h分别为9.21×104、10.15×104和2.71×104。保存60d的培养基复苏培养未能培养出阿米巴滋养体。
3 讨论
侵袭内阿米巴是蛇、鼍等爬行动物的寄生原虫。它虽然已被用于一些医学院校的寄生虫学教学过程，但具体的培养和保种方法以及哪种培养基的培养和保种效果较好等方面的问题尚未见文献报道。从本实验用A、B、C 3种培养基复苏培养和转种培养效果的比较来看，以B（营养琼脂血清盐水）培养基对该阿米巴生长和增殖效果最好。三次重复转种培养结果也说明了这一点，在24h、48h和72h 3个时点均能在此培养基中检查到最多的虫体数量（包括滋养体和包囊）。从实验结果可见：侵袭内阿米巴滋养体在培养基中的数量高峰有时在接种后24h，有时是48h，这可能与每次接种时接种液的量和接种液中的虫体在数量和生长状态等方面存在差异有关。但在多数情况下，滋养体数量高峰出现在接种后24～48h之间。而冷藏9d的阿米巴复苏培养直到接种后约96h培养基中才出现大量的滋养体，推测可能是由于冷藏前培养基中虫数特别是包囊较少所致。观察发现,通常培养48h的侵袭内阿米巴滋养体活动能力较强。在A、B、C 3种培养基中似乎以在B培养基中生长的虫体活动能力稍弱。由于观察次数有限，加上阿米巴活动能力的判断受主观因素影响较大，因此这方面的观察结果只具有参考意义。根据以上结果可以认为，培养48h左右的侵袭内阿米巴滋养体数量较多、活动能力较强可能是其用于教学观察阿米巴运动和用于科学研究与虫体收集较佳的时期。关于A、B、C 3种培养基保种效果的比较，亦以B培养基最好。从培养基制备的难易程度来看，A培养基的制备是最麻烦的；而B、C两种培养基的固相是一致的，制备都比较简单。其中，配制B培养基上层液相需要用到林格氏液，如果从医院购买商品化的已灭菌的注射用林格氏液，则该双相培养基的制备是最简单的；C培养基的上层液相的配制也较为简单，但由于它含有蛋白胨，营养较丰富，容易长菌，较难保存。综上所述，B（营养琼脂血清盐水）培养基是一种效果较好、方便实用的侵袭内阿米巴培养和保种的培养基。保种实验还提示:（1）短期4℃保存完全不影响侵袭内阿米巴的生长。（2）保种时应使培养基含有较多的包囊，因为包囊较滋养体抵抗力强、存活时间较长，复苏培养时较易于成功。（3）4℃条件下保种每月应转种一次，以确保侵袭内阿米巴能长期保种和复苏成功。（4）在保种转种前虫体在30℃孵育1h左右,可能有利于提高侵袭内阿米巴的复苏培养的成功率。因为侵袭内阿米巴在形态和生活习性上与溶组织内阿米巴很接近，且较溶组织内阿米巴易于培养和保种，所以人们往往利用它作为溶组织内阿米巴的替代虫种。一方面，侵袭内阿米巴于27～28℃虫体伪足形成迅速，是观察阿米巴运动的理想虫种，可供教学使用；另一方面，可利用它为研究溶组织内阿米巴的生理与生化特性、培养诊断方法和抗阿米巴药物的开发提供帮助［2,3］。同时,侵袭内阿米巴对人无感染性，用其代替溶组织内阿米巴用于医学实验教学将更为安全。
【参考文献】
［1］ 陈佩惠,孔德芳,李慧珠,等. 人体寄生虫学实验技术［M］.北京：科学出版社，1988,37～39.
［2］ Makioka A, Kumagai M, Kobayashi, et al. Inhibition of excystation and metacystic development of Entamoeba invadens by the dinitroaniline herbicide oryzalin［J］. J Parasitol, 2002,88（5）:994～999.
［3］ 陈金富,黄翔,刘友尧,等.溶组织内阿米巴与侵袭内阿米巴的化学元素和氨基酸的研究［J］.中国人兽共患病杂志, 1995,11（4）:11～14.
作者单位：广州医学院医学检验系2004级，510182; 广州医学院病原生物学教研室,广东 广州 510182.