葛根素对大鼠脑缺血再灌注后梗死范围和锥体细胞的影响

【摘要】  　　目的 探讨葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注时梗死范围和锥体细胞的影响。 方法 72只SD大鼠随机分为S组（假手术组）、IR组（缺血再灌注组）和P组（葛根素预处理组），每组24只，依术后处死动物时间的不同每组又分为3个亚组，每亚组8只，同时制作大脑中动脉缺血2h后再灌注损伤的SD大鼠模型。用TTC染色法测定梗死体积，HE染色观察海马区锥体细胞数。 结果 S组未见梗死灶，P组脑梗死范围明显比IR组缩小（P<0.05或P<0.01）。P24h、P72h组神经元损伤程度较IR24h、IR72h组轻；P24h、P72h组存活锥体细胞数明显多于IR24h、IR72h组（P=0.014，P=0.004）。 结论 葛根素预处理能减少大鼠局灶性脑缺血后梗死范围和锥体细胞的死亡。

【关键词】  葛根素 预处理 梗死 缺血再灌注 锥体细胞

　　Impact of preconditioning of puerarin on infarction size and pyramidal cell after focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats.

　　PAN Deng, TAN Jun, ZHAO Xiu-juan.

　　（Department of Gerontology, The Xinxiang Municipal First People’s Hospital, Xinxiang 453000, Henan, P.R. China）
　　Abstract：Objective  To investigate influence of puerarin preconditioning on infarction size and pyramidal cell after focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats.  Methods  The rat model of middle cerebral artery occlusion （MCAO） were establishment. SD rats （n=72） were randomly divided into three groups each consised of 24 rats. S group only exposed anatomically without reperfusion. Rats in IR group and P group were give reperfusion with administration of normal saline and puerarin through abdomen, respectively. Based on the hours after the rats were killed, the rats in each group were divided into three subgroups each consisted of 8 rats. TTC staining was applied to determine infarction volume. The pathohistology in hippocampus was examined by HE staining.  Results  There no infarct foci were observed in S group. The infarct size of P group were significantly smaller than that of IR group, respectively （P<0.05 or P<0.01）. The extent of damange to hippocampus neurons in rats of P group were slighter significantly than that of IR group. The quantity of viable pyramidal cell in rats of P group at various time was significant mor than that of IR group （P=0.014, P=0.004）.  Conclusion  The preconditioning of puerarin can reduce the infarction area of focal cerebral ischemia due to reperfusion injury and protect the pyramdalcells in rats.

　　Key words：Puerarin; Preconditioning; Infarction; Ischemia reperfusion; Pyramidal cell

　　缺血性脑血管疾病是严重危害人类健康的一种疾病，其有效治疗一直是人们追求的目标。近年来研究发现预先给予脑组织短暂缺血，可以增强其对再次缺血的耐受性，引起众多学者的重视。用药物代替预缺血，有助于防治缺血性脑血管疾病。葛根素是传统中药，有研究表明，葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用［1］。本实验以大脑中动脉缺血再灌注大鼠为实验模型，旨在观察葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注时脑梗死范围和锥体细胞的影响。

　　1  资料与方法

　　1.1  实验动物  雄性SD大鼠72只（郑州大学医学院实验动物中心提供，合格证号0001743），体重250～350g，清洁级。饲养于恒温净化通风动物房，自由进食和饮水，室温（25±2）℃。

　　1.2  主要药品、试剂和仪器  葛根素注射液（Puerarin injection）0.2g（商品名，布瑞宁，批号20050401，北京四环科宝制药有限公司），乌拉坦（上海第一生化制药厂），三苯基四氮唑（Triphenyltetrazolium chloride, TTC）（美国Sigma公司），兔抗p53多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司，北京中山生物有限公司分装）。Leica RM 2135 石蜡切片机、Leica Microsystems AG （CH-9435 Heer brugg）、Leica Quin 图像信号采集与分析系统（均为德国Leica公司）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  动物模型制作  参考Longa等［2］的制作大脑中动脉阻塞（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）缺血再灌注模型。以20%乌拉坦（5ml/kg）腹腔注射麻醉成功后，仰卧位，于颈部皮肤常规纵行切口约2.5cm，钝性游离左侧颈总动脉（CCA），结扎同侧CCA近心端和颈外动脉（ECA）分叉部，距CCA末端约5mm处剪口，将直径0.2mm尼龙线沿颈内动脉（ICA）方向插入，深度由分叉部计算约（18.5±0.5）mm，于ICA近心端结扎该动脉，全层缝合切口。于脑缺血手术2h后抽出尼龙线1cm行再灌注，实验中保持大鼠体温（37±0.5）℃至苏醒。麻醉清醒后大鼠MCAO模型的神经功能评分采用Zea Longa评分法［3］，0分：无神经系统功能缺失症状，活动正常者；1分：不能完全伸展对侧前爪者；2分：出现左侧Horner征，爬行时出现向右转圈者；3分：行走时身体向右侧偏瘫侧倾倒者；4分：不能自发行走者，意识丧失者。评分为0分和4分者均被剔除。

　　1.3.2  实验分组  72只SD大鼠随机分为3组：假手术组（S组，n=24）：仅暴露双侧CCA不结扎，30min后缝合颈部切口；缺血再灌注组（IR组，n=24）：缺血2h后再灌注；葛根素组（P组，n=24）：术前3d经腹腔注射葛根素注射液（100mg/kg），1次/d，共3次。各组大鼠分别按脑缺血再灌注后2h、24h、72h处死动物时间的不同分为不同亚组，每亚组8只，分笼饲养。

　　1.3.3  标本采取  在SD大鼠脑缺血再灌注后第2h、24h、72h，S组、IR组和P组分别麻醉后经左心室灌注生理盐水100ml处死，断头后迅速取脑，其中4只低温冷冻后切片，用于TTC染色；余4只取视交叉前海马区2mm厚脑组织，用4%多聚甲醛固定行病理组织学检查。

　　1.3.4  TTC染色及脑梗死体积测量  断头取脑后，在距额极2mm处向后连续等距离切取2mm厚的5个冠状切片，置2%TTC中37℃水浴避光孵育，30min后显色完全（白色为梗死区），用4%多聚甲醛固定。摄片、计算机图像分析，以缺血对侧脑片的面积减去缺血侧TTC染色正常区的面积为脑梗死面积，所有脑片梗死面积之和乘以脑片厚度即为脑梗死体积。

　　1.3.5  病理组织学检查  梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续切片，厚度4μm。切片常规脱水、透明，苏木素染色5min，盐酸乙醇分化30s，伊红复染2min，水洗、脱水、透明，中性树脂封片。光学显微镜下观察海马中央区组织的形态学变化。在高倍镜（×400）下采用显微测微尺计数右侧海马中央区3个不同部位单位面积（0.04mm2）的锥体细胞数，取其均值。

　　1.4  统计学处理  数据以x±s表示，用SPSS13.0统计软件分析，组间比较采用t检验和单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  TTC染色  正常组织为玫瑰红色，梗死组织为白色，脑梗死体积占大脑皮层体积的百分比为梗死范围。S组未见梗死灶，P组脑梗死范围明显比IR组缩小（P<0.05或P<0.01）， 见表1。

　　表1  各组脑梗死在不同时间TTC染色表现（略）

　　注：与IR组比较，aP=0.002，t=3.787；bP=0.008，t=3.092；cP=0.012，t=2.881。

　　2.2  病理组织学检查和锥体细胞数目  S组脑组织结构正常，锥体细胞排列整齐，胞体较大，核仁明显。IR2h、P2h组海马区3、4层细胞形态基本正常，少量锥体细胞表现为细胞皱缩，核染色质浓缩；IR24h、IR72h组基底节区、顶叶及海马区锥体细胞间隙增宽，胞体变性，胞质呈嗜酸性，染色较淡，核固缩、核碎裂和核溶解等；P24h、P72h组海马区也可见神经元变性及死亡。P组存活的锥体细胞数明显多于IR组（P=0.014，P=0.004），见表2。

　　表2  各组活锥体细胞数比较（略）

　　注：与S组比较，aP＜0.0001，t=5.864，cP=0.0015，t=3.943；bP＜0.0001，t=7.086，dP=0.0023，t=3.719。与IR组比较，eP=0.014，t=2.806；fP=0.004，t=3.439。

　　3  讨论

　　脑缺血再灌注是临床常见的病理过程，缺血后梗死灶的大小与神经功能缺损程度密切相关，了解脑梗死后梗死体积的变化情况可以为脑缺血的治疗提供参考依据。TTC染色是评价脑梗死的最直接、最有意义的指标，不仅可以判定梗死的成功与否，也可以定量观察、测定梗死范围的大小。本组研究结果显示，P组梗死范围较IR组明显减小，说明葛根素预处理后可减小大鼠局灶性脑缺血再灌注后的脑梗死范围。本研究结果还提示，大鼠局灶性脑缺血再灌注后梗死范围在缺血2～24h内逐渐增大，于24h达到最大，与文献报道基本一致［4,5］。脑缺血再灌注后神经元的死亡是一个极其复杂的病理过程，主要表现为坏死和凋亡两种形式。王贤军等［6］研究发现,局灶性脑缺血6h开始出现凋亡细胞，随梗死时间延长凋亡细胞逐渐增多，血流量恢复引起缺血再灌注损伤，最终导致迟发性神经细胞凋亡。本研究结果显示,P组存活的锥体细胞数量明显多于IR组（P<0.05或P<0.01），说明葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注后的神经元有一定的保护作用。本研究结果提示，葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注的损伤有保护作用。短暂的缺血预处理常能发挥较好保护作用，但严重缺血，可使预处理的保护作用减弱甚至消失，葛根素是否如此有待进一步探讨。另外，葛根素预处理的时间、次数、剂量等都有待进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］ 高鹏, 夏成青, 王佩燕, 等. 葛根素对全脑缺血再灌注后脑组织诱导型一氧化氮合酶影响的实验研究［J］. 中华急诊医学杂志, 2001, 10（2）:85～86.

　　［2］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle artery occusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989, 20（1）:84～91.

　　［3］ Raymond J, Roy D. Safety and efficacy of endovascular treatment of acutely ruputured aneurysms［J］. Neurosurgery, 1997, 41（6）:1235～1246.

　　［4］ 曹霞, 曹秉振, 郭述苏. 大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型的时间梗死体积相关研究［J］. 解放军医学杂志, 2000, 25（2）: 123～124.

　　［5］ 程敏,郭淮莲. 大鼠脑缺血再灌注后梗死体积的动态变化［J］. 中风与神经疾病杂志, 2005, 22（6）: 536～537.

　　［6］ 王贤军, 夏青, 蔡洪信, 等. 局灶性脑梗死后半暗带区皮层血流量与神经细胞凋亡的实验研究［J］. 中国病理生理杂志, 2006, 22（5）: 968～971.

作者单位：新乡市第一人民医院老干部病房，河南 新乡 453000; 新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453002; 新乡市第二人民医院内二科，河南 新乡 453002.