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【摘要】 目的 研究环氧化酶-2（COX-2）与血管内皮生长因子-C（VEGF-C）在胃癌中的表达与生物学行为的关系。 方法 采用免疫组织化学染色法，检测54例胃癌原发灶标本COX-2与VEGF-C蛋白表达的情况，分析其与胃癌淋巴转移之间的关系。 结果 所测54例胃癌组织中，COX-2及VEGF-C的表达阳性率分别为70.4%（38/54）和66.7%（36/54）。COX-2及VEGF-C表达与淋巴结转移呈明显相关性（P<0.01），但与肿瘤分化程度和有无浆膜浸润等无明显相关（P>0.05）。VEGF-C与肿瘤的TNM分期相关（P<0.01）。 结论 COX-2及VEGF-C在胃癌组织中的表达与肿瘤的淋巴转移密切相关；COX-2可能通过上调VEGF-C表达，促进胃癌淋巴管生成，并顺次导致淋巴结转移的发生。
【关键词】 胃肿瘤 环氧化酶-2 血胃内皮生长因子-C淋巴转移
COX-2 and VEGF-C expression in gastric cancer and their relationship with lymph node metastasis.
ZHANG Yin-long, YOU Tao, WANG Xiang-yi, et al.
（Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325027, Zhejiang, P. R. China）
Abstract：Objective To investigate the expression of cyclooxygenase-2（COX-2） and vascular endothelial growth factor-C（VEGF-C） in gastric cancer and their relationship with tumor behavior. Methods The expression of COX-2 and VEGF-C in 54 gastric cancer samples were detected by immunostaining and their relationship with lymph node metastasis were analyzed. Results The expression rates of COX-2 and VEGF-C were 70.4%（38/54）, 66.7%（36/54） respectively in 54 gastric cancer specimens. The expression of COX-2 and VEGF-C were significantly correlated with lymphatic metastasis （P<0.01）, The expression of COX-2 and VEGF-C was not correlated with tumor clifferentiation and serosea invasion （P>0.01）. The expression of VEGF-C was signiticantly correlated with tumor TNM stage. Conclusion In gastric cancer, the expression of COX-2 and CEGF-C are significantly associdted with lymphatic metastasis, COX-2 may up-regulate the expression of VEGF-C, which induces lymphangiogenesis and accordingly contritutes to lymphatic metastasis.
Key words：Stomach neoplasms; COX-2; VEGF-C; Lymph node metastasis
胃癌的首要转移途径是通过淋巴系统，如果能掌握其淋巴转移的规律，将为控制淋巴转移提供理论依据，但目前胃癌淋巴转移的分子机制尚未明了。环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）和血管内皮生长因子-C（Vascular endothelial growth factor-c, VEGF-C）可通过促进细胞增殖，抑制细胞凋亡及促进肿瘤血管生长等多种机制，参与调节肿瘤发生和发展过程，但对COX-2表达与胃癌淋巴管生长和淋巴结转移之间的关系研究迄今为数不多。为探讨胃癌淋巴转移的分子机制［2］，我们采用免疫组织化学方法，检测COX-2及淋巴管生长相关因子-VEGF-C在胃癌组织中的表达情况并与淋巴结转移关系进行相关性分析。
1 材料和方法
1.1 标本来源 收集我院2003年元月～2005年6月，手术切除胃癌原发灶标本54例，其中男性32例，女性22例，年龄23～81岁，平均（54±15）岁。入选标准：①经病理检测证实为胃腺癌；②术前未接受放、化疗；③有完整的临床、病理资料。临床病理分期采用国际抗癌联盟（UICC）第5版TNM分期法。
1.2 免疫组织化学染色 采用链霉素-生物素过氧化酶（SP）染色法，具体操作步骤按SP免疫组化试剂盒说明书进行。石蜡包埋，标本层厚4um连续切片，常规脱蜡至水。切片置10mmol/L柠檬酸缓冲液（PH6.1）中，微波加热（95℃，10min）修复抗原，0.3%过氧化氢甲醇溶液室温孵育30min阻断内源性过氧化物酶活性。COX-2一抗为免抗人多克隆抗体（Santz Cruz, USA），工作浓度为1：200；VEGF-C一抗为免抗多克隆抗体（Zymed, USA），工作浓度为1：100。4℃过夜孵育；PBS冲洗3次，每次5min，滴加生物化二抗，37℃孵育20min；PBS冲洗3次，每次5min，滴加链霉素一过氧化物酶溶液，37℃孵育20min；PBS冲洗3次，每次5min，DAB显色，苏木精复染，透明，脱水，封片。
1.3 免疫组织化学结果评价 以PBS替代一抗作阴性对照，用已知COX-2和VEGF-C表达阳性的乳腺癌组织切片作为阳性对照。胞浆内和/或细胞核出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞，在400倍光镜下至少计数200个肿瘤，如标本的阳性肿瘤细胞数超过20%，则此标本定为COX-2和VEGF-C阳性，如少于或等于20%则定为阴性。
1.4 统计学方法 χ2检验和确切概率法。
2 结果
2.1 COX-2与VEGF-C蛋白在胃癌中的表达 COX-2及VEGF-C阳性表达的胃癌组织，在镜下均表达为细胞浆和/或细胞核内出现棕黄色颗粒，且绝大多数定位于肿瘤组织中，所测54例胃癌组织标本中，COX-2及VEGF-C的表达阳性率分别为70.4（38/54）和66.7%（36/54）。
2.2 COX-2与VEGF-C蛋白表达与胃癌病理因素的关系 本组所测54例胃癌标本中，COX-2和VEGF-C在有淋巴结转移者中的阳性表达率明显高于无淋巴结转移者（P<0.01），且VEGF阳性表达与胃癌的TNM分期呈明显相关（P<0.01），但上述两指标的阳性表达与患者的分化程度，有无浆膜浸润等因素养均无明显相关（P>0.05），见表1。
表1 COX-2与VEGF-C表达与胃癌病理因素的关系（略）
3 讨论
COX-2是一种诱导酶，生理状态下大多数组织不表达或微量表达，但在正常组织癌变过程中表达上调，可能是肿瘤发生的早期事件之一［2］。动物实验发现，COX-2表达增加前列腺素E2（PGE2）的合成，PGE2可诱导细胞增殖并刺激BcL-2蛋白表达，而后者抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的发生［1,3］。肿瘤细胞分泌多种蛋白酶降解细胞外基质，是肿瘤侵犯和转移的首要步骤和分子基础。COX-2过度表达可降低介导细胞间粘附的E-钙粘蛋白（E-cadherin）活性，提高细胞与细胞外基质蛋白粘附能力，增加肿瘤细胞的侵袭力［4］；COX-2过度表达还直接上调使细胞外基质降解的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达［5］，MMP-2是肿瘤侵犯和转移过程中降解细胞外基质的蛋白水解酶系统的重要成份之一，破坏细胞外基质和基底膜，促进肿瘤的侵袭和转移。VEGF-C为淋巴管生长促进因子，可与淋巴管内皮细胞表面的VEGFR-3受体特异性结合，继而诱导毛细淋巴管的增殖和生长，促进肿瘤内淋巴管生长，最终导致淋巴结转移的发生［6］。在已发生淋巴结转移的乳腺癌和胰腺癌等多种上皮性肿瘤中，均观察到VEGF-C的高表达现象［7,8］。作为重要的生化调节因子，COX-2在肿瘤腺管生成方面发挥了一定作用。Su等在人肺腺癌细胞中发现［9］，COX-2表达可激活HER-2/Neu酪氨酸激酶受体，并通过EP-1受体依赖途径，上调VEGF-C基因表达，进而影响肿瘤淋巴管生长和淋巴结转移，为从分子机制探讨COX-2与VEGF-C间的相互关系提供了实验依据。我们的研究结果显示，胃癌中存在COX-2与VEGF-C的过度表达现象，且上述指标表达与肿瘤淋巴结转移状态明显相关；而VEGF-C高表达状态则与胃癌TNM分期明显相关，但COX-2表达在Ⅰ/Ⅱ期胃癌中即明显出现，从而揭示COX-2过表达可能是胃癌淋巴结转移过程中的早期事件，并次第调节VEGF-C表达和促进微淋巴管形成，最终导致肿瘤淋巴结转移的发生。通过抑制COX-2及VEGF-C来影响肿瘤淋巴管生成，有望成为防治胃癌淋巴结转移的一个新靶点。
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作者单位：温州医学院附属二院普外科，浙江 温州 325027.