广州管圆线虫对淡水螺感染性的实验研究

【摘要】  目的 比较研究广州管圆线虫对褐云玛瑙螺、福寿螺、中国圆田螺三种食用淡水螺感染性。 方法 在相同的条件下，用广州管圆线虫I期幼虫感染三种螺2、4、8、12及24h后，随机抽样各20只，分别饲养于置有滤水器、水温（24±1）℃的玻璃缸内：记录感染2周内各组螺死亡数。第15d开始解剖，记录螺软体重量和感染虫数。同时设不感染螺对照组。 结果 三种螺感染后均有死亡，第5d死亡数达高峰。三种螺的感染率和死亡率与螺的种类及感染时间均无相关性，福寿螺感染8、12及24h均显著高于感染2h（P值均<0.05）；褐云玛瑙螺感染24h均显著高于感染2、4、8及12h的（P值均<0.05）,中国圆田螺感染2、4、8、12及24h各组间差异均无显著性（P值均>0.05）,褐云玛瑙螺感染8、12及24h的虫负荷均显著高于福寿螺和中国圆田螺（P值均<0.05）。 结论 褐云玛瑙螺、福寿螺对广州管圆线虫易感并有较高的相容性，其中褐云玛瑙螺的相容性较强。

【关键词】  广州管圆线虫；褐云玛瑙螺；福寿螺；中国圆田螺；相容性

　Experimental study on the infectiveness of Angiostrongylus cantonensis to three species of freshwater  snails.

　　LIU Yi, GAO Shi-tong, GENG Yi-jie, et al.

　　（Baoan District Gongming Health Center, Shenzhen 518000, Guangdong, P. R. China）

　　Abstract：Objective  To compare the compatibility of three species of freshwaler snails, Achatina fulica; Bellamya aeruginosa; Cipangopaludina chinensis with Angiostrongylus cantonensis.  Methods  The three species of snails were infected by the first-stage larvae of Angiostrongylus catlonensis under same conditions. Twenty snails of each species were randomly sampled 2、4、8、12, 24 hours after exposed to the larvae. Each group was put into an aquarium.  Another group of the same species and number was taken as control.  All the aquaria were equipped with a filter, the water temperature was kept at （24±1） ℃. In the first two weeks, the number of death was recorded. Later,the snails were successively examined to record the weight and worm burden of each snail.  Results  Some snails were dead mostly occurred on the fifth day of infection. The death rate and infection rate were not associated with exposure time and snail species. Worm burden of Achatina fulica 8, 12 and 24 hours after infection was significantly higher than the other two species 2 hours after infection （P<0.05）. However,the worm density of Achatina fulica and B.aeruginosa was not significantly different but higher than that of Cipangopaludina chinensis. No significant difference in worm burden was observed in Cipangopaludina chinensis among each groups 2, 4, 8, 12 and 24 hours after infection （P>0.05）. The worm burden of Achatina fulica 8, 12 and 24 hours after infection was significantly higher than that of Bellamya aerugynosa and Cipangopaludina chinensis （P<0.05）.  Conclusion  Achatina fulicaand and Bellamya aeruginosa are susceptible to Angiostrongylus cantonensis as well as a higher compatibility with A.cantonensis. The compatibility of A. fulica with Angiostrongylus cantonensis is superior to the other species.

　　Key words：Angiostrongylus cantonensis; Achatina fulica; Bellamya aeruginosa; Cipangopaludina chinensis; Compatibility

　　近年来，广州管圆线虫病的感染呈上升趋势。自2006年6月北京友谊医院收治全市首例广州管圆线虫病患者以来，已确诊广州管圆线虫病的患者已增至70余人，其中绝大多数患者都因食用了凉拌福寿螺而发病。福寿螺是广州管圆线虫的主要中间宿主之一，随着人们饮食习惯的改变，广州管圆线虫病对人类的致病机会不容忽视。随着气候变暧和气象异常事件的频繁发生，专家预测螺类传播媒介的自下而上生存范围可能扩大，这对寄生虫病的发生、发展有重要影响［1］。自1986年福寿螺（Pomacea canaliculata）首次被证明是广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）的适宜中间宿主以后，日本、台湾地区、中国大陆等地相继发生了自然感染的福寿螺［2］，并成为中国大陆文笔这圆线虫病传播中是为主要的中间宿主之一［3］。但是，广州管圆线虫的中间宿主多达50余种。国内市场上常见的褐云玛瑙螺（Achatina fulica）、中国圆田螺（Cipangopaludina chinensis）等食用淡水螺也被证明可以自然感染广州管圆线虫［4］。为掌握这些食用淡水螺的潜在传播危险性，我们对3种食用淡水螺与广州管圆线虫的相容性进行了实验研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  中间宿主3种食用淡水螺  福寿螺和中国圆田螺于2006年9月采自深圳龙岗癸涌地区,褐云玛瑙螺于2006年9月采自深圳市罗湖区植物园， 3种螺均在实验室繁殖后代，实验室繁殖的后代无广州管圆线虫感染，以此作为广州管圆线虫攻击感染的实验材料。

　　1.1.2  广州管圆线虫1期幼虫  广州管圆线虫模型动物购自中山大学基础医学院寄生虫学教研室，模型动物的建立首先将自然感染广州管圆线虫的褐云玛瑙螺，于2006年7月采自深圳市南山区。将其压碎、去壳、组织匀浆后，按照文献［9］消化法，置于人工消化液（0.2%胃蛋白酶，0.7% HCI）k 37℃2h，解剖镜下分离广州管圆线虫Ⅲ期幼虫。取80条活跃幼虫灌胃感染SD大鼠，6周后，每隔12h收集1次24h内的粪便，将所有粪便浸泡在去氮水中，过滤、淘洗5～6次，每次静置15～30min后倾除上清液，用去氯水稀释沉渣，配制Ⅰ期幼虫混悬液，备用。

　　1.2  方法

　　1.2.1  感染螺  将3种螺分别置于有充气泵和滤水器的恒温（24±2）℃玻璃缸（59cm×55cm cm×33cm）中饲养1周，待其生存状态稳定后进行感染。将过渡、淘洗后的广州管圆线虫Ⅰ期幼虫混县液搅匀，分成2份，每份含Ⅰ期幼虫约150 000条，分别倒人2个感染缸内，加水至深1cm。随机取3种螺各50只，混匀，随机放入2个感染缸内使其感染。分别于感染后2、4、8、12及24h从2个感染缸中随机取3种螺各20只，清水洗净，另外取未感染的3种螺各20只作为阴性对照。

　　1.2.2  饲养  取感染后不同时间的3种螺各20只常规饲养在带充气泵和滤水器的玻璃缸中。统计2周内死亡情况。

　　1.2.3  解剖  感染螺饲养2周后解剖，在解剖镜（Nikon，日本）及显微镜（Nikon，日本）下检查螺体感染情况。将螺压碎、去壳、称重，剪碎软体，置绞碎机进一步粉碎，然后倒入量杯，加入人工消化液（按“2g胃蛋白酶/1 000ml及0.7%HCI”配制），于37℃消化2h。检查螺体内幼虫。

　　1.2.4  观察指标  包括实验螺数、已感染螺数、死亡螺数、检出幼虫数、各螺的重量等。统计死亡率、感染率、感染度和虫密度。死亡率=死亡螺数/实验感染螺总数；感染率=被感染螺数/实验感染螺总数；感染度即为虫负荷，是每一螺体内幼虫的绝对数量；虫密度=虫负荷/螺重量。

　　1.2.5  统计与分析  采用SPSS（11.0）软件统计分析螺 死亡率、感染度、感染率。用Logistic回归分析死亡率、感染率与螺的种类及感染时间相关性。用箱式图（中位数、四分位数、最大值、最小值）描术3种螺的虫负荷与虫密度随感染时间的变化。用Kruskal-Wallis法检验同种螺的虫负荷和虫密度与感染时间的关系，检验相同感染时间组 3 种螺的虫负荷和虫密度的差异。如差异显著，则进一步对各观察值取秩次并通过 方差分析法进行两两比较。

　　2  结果

　　2.1  三种螺死亡情况  感染后2周内3种螺的死亡数相似，福寿螺占35%（8/20）、中国圆田螺占45%（9/20）、褐云玛瑙螺占35%（8/20）。死亡高峰为感染第1周，占总死亡数的41%（22/60）。第8天后死亡率明显降低。通过Logistic 回归分析结果表明，死亡率与螺的种类无相关性（表1）。

　　2.2  感染率  χ2检验结果显示、感染24h褐云玛瑙螺的感染率（75%）显著高于福寿螺（50%）和中国圆田螺的感染率（41%）（χ2=7.348,P<0.05），福寿螺和中国圆田螺的感染率差异均无显著性（P>0.05）。

　　表1  三种不同淡水螺在不同感染时间的死亡率（略）

　　Table 1  The death rate of different fresh water snail on different time

　　2.3  感染度

　　2.3.1  虫负荷  福寿螺和褐云玛瑙螺的虫负荷在不同感染时间组差异具有显著性（P<0.05）。4、8、12、24h组显著高于2h组，其他各组之间差异不显著。中国圆田螺不同感染时间组，差异无显著性（P>0.05）。相同感染时间的三种螺比较显示，2、4h 感染组，虫负荷差异无显著性（P>0.05），而8、12、24 h 感染组虫负荷，褐云玛瑙螺显著高于其他2种螺（P<0.05）（图1）。

　　图1  三种淡水螺的虫负荷比较（略）

　　Fig 1  Comparison on worm burden among three species of fresh water snails

　　2.3.2  虫密度  感染24h三种螺感染虫密度两两比较均有显著性，其中褐云玛瑙螺的虫密度显著高于福寿螺和中国圆田螺（P<0.05）。福寿螺感染虫密度也显著性的高于中国圆田螺（P<0.05）（图2）。

　　图2  三种淡水螺虫密度比较（略）

　　Fig 2  Comparison on worm density among three species of fresh water

　　3  讨论

　　寄生虫的感染性和毒性与宿主的抵抗力都是寄生关系的直接表现，但它们之间常有品系的差异。应用相容性可以更好地表达寄生虫和宿主之间的相互关系［5］。相容性包括寄生虫对宿主的识别、穿透及在宿主体的发育［6］。评价其相容性的指标有：感染致死率、感染率、感染度、发育历期等。实验结果表明，三种螺感染广州管圆线虫后，死亡率与感染相关，但与螺的种类及感染时间无相关性。感染螺的死亡主要集中在感染后1周内，可能与广州管圆线虫幼虫的侵入与移行有关。螺的感染率与种类有关，褐云玛瑙螺和福寿螺均易感，寄生虫与贝类宿主之间存在种宿特异性，我们的实验证实褐云玛瑙螺是广州管圆线虫的最适中间宿主。螺的虫负荷、虫密度，存在较大的差异。虫密度更加说明褐云玛瑙螺对广州管圆线虫的易感性，表明在螺的群体中存在易感的种类，在很短的感染时间内即可达到较大的虫负荷中虫密度。由于虫负荷和虫密度的个体差异不呈正态分布，不能用算术均数统计描述。故本研究采用了箱式图描述三种螺的虫负荷与密度的变化。虫负荷常被用于评价感染［7］。本研究中的三种螺体重差异较大，若单用虫负荷来衡量与各种螺的相容性可能会掩盖其真实性，故作者采用了虫密度这一指标，从而解决了由于螺体重差异较大所带来的偏差。用虫负荷进行统计分析显示，褐云玛瑙螺的感染度显著高于其他两种螺；而用虫密度进行统计分析又表明，褐云玛瑙螺的感染度与福寿螺和中国圆田螺差异有显著性。这一结果提示，褐云玛瑙螺作为广州管圆线虫的中间宿主应当受到重视。福寿螺是外来入侵物种，不仅影响入侵地的生态，也是广州管圆线虫的重要中间宿主［8］。近年来广州管圆线虫病的几次暴发流行足以证明这一点［9］。褐云玛瑙螺和中国圆田螺也是市场常见的两种淡水食用螺，已经被证实可以自然感染广州管圆线虫［7］，而且因食用褐云玛瑙螺和中国圆田螺引起的广州管圆线虫病已有报道［10］，本研究可以看出褐云玛瑙螺和福寿螺对于传播广州管圆线虫病存在很大的潜在危险性，应当提高警惕。

【参考文献】
  　［1］ MeCarthy JJ, Canziani OF, Leary NA, et al. Climate change Impacts,adaptation and vulnerability contribution of working groups to the third assessment report of the intergovemmental panel on climate change（IPCC）［M］.2001, Cambridge University Press, UK.

　　［2］ Nishimura K, Mogi M, Okazawa T et al Angiostrongylus cantonensis infection in A. Canaliculatus in Kyushu. Japan［J］. Southeat Asian J Trop Med Public Health,1986, 17:595～600.

　　［3］ Yen CM. Chen EH, Cheng CW, A Survey of Amplullarium canaliculatus for natural infection of Angiostrongylus cantonensis in south Taiwan［J］. J Trop Med Hyg, 1990,93:347～350.

　　［4］ 潘长旺，刑文茑， 梁韶辉，等. 温州福寿螺体内首次发现广州管圆线虫幼虫［J］. 中国寄生虫病防治杂志,1998，11（78）：11～14.

　　［5］ 林金祥，周晓农，李莉沙，等. 铜锈环棱螺作为广州管圆线虫中间宿主的发现［J］. 中国人畜共患病杂志，2005，21：21～26.

　　［6］ 李莉莎, 周晓农, 林金祥, 等. 福建省广州管圆线虫6种新宿主的发现及疫源地的感染率周年变化［J］. 中国人畜共患病杂志，2006，22（6）：533～537.

　　［7］ 刘和香, 张仪, 周晓农, 等. 不同发育期福寿螺对广州管圆线虫易感性的实验研究［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，5：24～27.

　　［8］ 林巍, 王小同. 中国大陆广州管圆线虫病流行病学调查现状［J］.中国人畜共患病杂志,2004，2（11）：26～29.

　　［9］ 陈宝建, 李友松, 林金祥. 福建省长乐市广州管圆线虫暴发感染及疫源地的调查研究［J］.寄生虫病与感染性疾病,2003，1（1）：5～7.

　　［10］ 许隆祺, 方悦怡, 许景田, 等. 我国食物源性寄生虫病的流行形势与对策［J］.中国寄生虫病防治杂志,1999，12（2）：84～87.

作者单位：深圳市科技计划项目（2007年度） 深圳市宝安区公明预防保健所，广东 深圳 518000； 深圳市疾病预防控制中心分子生物研究室,广东 深圳 518020.