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【摘要】 目的 分析流式细胞术（FCM）用于强宜性脊柱炎（AS）患者人类白细胞抗原B27（HLA-B27）表达情况的测定效果，同时以药物特异性聚合酶链反应（SS P-PCR）进行对照。 方法 采用 FCM法检测74例临床疑似AS患者的HLA-B27，将二者结果进行分析比对。 结果 两种检测方法检测，结果符合率为95.9％， 经Kappa值评价有很强的一致性（K=0.95），无统计学意义（P>0.05）。 结论 FCM法是一种快捷、简便、高效的HLA-B27检测方法，适合于临床应用。
【关键词】 HLA-B27；强直性脊柱炎；流式细胞术
Comparison of results of detection of HLA-B27 antigen by cytometry and SSP-PCR.
HUANG He, SUN Yan-yan, SUI Wei-guo, et al.
（No.181 Hospital of PLA, Guilin 541000, Guangxi, P. R. China）
Abstract：Objective To evaluate the results of detection of HLA-B27 antigen in ankylosing spondylitis patients by flow cytometry （FCM） and compared with SSP-PCR. Methods A total of 74 samples from suspected ankylosing spondylitis were collected and the expression of HLAA-B27 was determined by FCM and SSP-PCR. Results The coincidence rate of the two methods was 95.9% without statistical significance （P>0.05）. Conclusion FCM is a rapid and reliable method for determination of HLA-B27.
Key words：HLA-B27; Ankylosing spondylitis; Flow cytometgry
强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是一组好发于20～40岁，主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限，X线显示有两侧骶髂关节炎为其特征的疾病。HLA-B27是位于人第6号染色体HLA基因B座位的一个等位基因， Brown等［1］报道强直性脊柱炎患者HLA-B27阳性率高达94％，而正常人群仅为 9％。对疑似AS患者进行HLA-B27检测，已成为临床重要的辅助诊断手段［2］。我们采用引物特异性聚合酶链反应（SSP-PCR）和流式细胞术（FCM）法同时检测74例临床标本，并进行比较，报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 从2007年1～5月间收集中国人民解放军第181医院门诊和住院部的74名临床疑似AS患者（男性56人，女性18人）的外周血2ml，EDTA抗凝。
1.2 SSP-PCR检测HLA-B27的表达
1.2.1 采用美国TBG公司生产的BioGene-ExpuzeTMDNA提取试剂盒，所用PCR仪为美国MJ Research公司生产的Opticon型实时荧光定量PCR仪。DYY-III型电泳槽，WD-9413B型凝胶成像分析仪，均由北京六一仪器厂生产。
1.2.2 检测方法 严格按照试剂盒说明书操作，于紫外分析仪上观察结果，如标本在markerl47-111bp之间出现扩增带（即135bp位置）即可判定为阳性，反之为阴性。
1.3 FCM检测HLA-B27的表达
1.3.1 主要试剂与仪器：HLA-B27FITC／HLA-B7 PE及相应的同型对照、红细胞裂解液，均由美国Beckman Coulter生产。流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司EPICS-XL型流式细胞仪。
1.3.2 标本处理 取100μl抗凝全血分别加入10μl HLA-B27 FITC／B7 PE，混匀，室温避光孵育15min；加人500ul细胞裂解液，混匀后室温避光放置15min，破坏红细胞；1 500r／min离心5min，弃上清；每管加入500μlPBS混匀，1 500r／min离心5min，弃上清，重复一次，500μlPBS重悬细胞，上机检测。
1.3.3 流式细胞仪检测：建立测定方案，每一项测定方案设定时要进行同型对照、颜色补偿的调定，以确定仪器适当的电压与增益。每次测定前以Flowcheck荧光微球调整仪器的光路和流路，使每一项指标的半峰高变异均小于2％。采用流式细胞仪常规检测方法，检测细胞数约为2 000个，自动分析获取结果，HLA-B27+／HLA-B7-表达率大于90％判定为阳性，其余为阴性。
1.4 统计学方法 两法一致性检验采用Kappa值评价（K值>0.7认为有很强的一致性），显著性检验采用四格表&检验。
2 结果
74例临床标本分别用FCM法和SSP-PCR法检测，有95.9％（71／74）的分型结果完全相同，两法经Kappa值评价有很强的一致性（K=0.95）；3例分型结果不一致， FCM法判为阳性，而SSP-PCR法判为阴性，两法分型结果无统计学意义（P>0.05），详细见表1。
3 讨论
AS是一种慢性、进行性和炎性疾病主要累及骶髂关节、脊柱骨软组织及四肢关节，表现为椎间盘纤维环附近结缔组织的骨化，椎间动关节和四肢关节滑膜的炎症和增生，严重者可失去劳动力［3］。大量研究证实，AS与HLAI类基因中B位点等位基因B27密切相关，其相对危险度达87.4［4］。因此，当临床根据症状、体征及X线检查怀疑为AS或其他脊柱关节病时,HLA-B27阳性可作为早期诊断及支持临床的重要指标［5］。目前检测HLA-B27的方法有补体依赖性微量淋巴细胞毒试验（CDC）、玫瑰花法、酶联免疫测定试验（ELISA）、流式细胞术（FCM）、 SSP-PCR法等。
表1 74例临床标本FCM法和SSP-PCR法检测结果比较（略）
K=0.95，P>0.05
目前国内外广泛应用的SSP-PCRB27等位基因检测技术，可直接对B27基因讲行分型，准确、特异，且能对B27的亚型进行分型，但技术要求较高，操作复杂，耗时约4h 。自20世纪90年代起，国外已将FCM结合单克隆抗体技术用于HLA-B27的检测，并取得了相当理想的结果［6］。其原理主要利用荧光标记的抗 HLA-B27的单克隆抗体和淋巴细胞表面的HLA-B27抗原结合，使细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可用流式细胞仪测定。根据流式细胞仪通道值的高低判断HLA-B27抗原的阳性或阴性。但HLA-B27的单克隆抗体不同程度与其它 HLA-B等位基因产物发生交叉反应，其中以HLA-B7的交叉最多见，而出现假阳性，我们采用HLA-B27／HLA-B7双染技术，同时每批试验均设阴性对照，并进行光路流路的校正和荧光补偿，大大提高了检测结果的可靠性。实验结果显示， FCM法和SSP-PCR法具有很强的一致性。SSP-PCR检测的是HLA-B27的基因型，而血清学技术检测的是HLA-B27的表型，两者所反映情况并不一致，即携带B27基因并不等于细胞表面一定有B27抗原的表达。本实验中经SSP-PCR检测为阳性，FCM法测定阴性的标本可能与某些患者细胞表面HLA-B27抗原不表达有关。与SSP-PCR法相比，FCM法更为快捷、简便、省时（一般在1h内即可完成），但需配置大型仪器。总体来说，FCM法测定HLA-B27的表达，操作简便、灵敏度高、特异性强、可重复性高、结果稳定，适合于临床应用。
【参考文献】
［1］ Brown MA，Pile KD，Kennedy LG，et al．HLA class l associations of mkylosing spondylitis in the white population in the United Kingdom［J］.Ann Rheum Dis，1996,55（4）：268．
［2］ 程小丽，杨玉琼，李旭，等．HLA-B27抗原检测与强直性脊柱的关系［J］.中国实验诊断学，2004，8（4）：403～404．
［3］ 王建中．临床流式细胞分析［M］．上海：上海科学技术出版社，2005,491～500.
［4］ 郑素琴，步坤钜，顾文娟，等．强直性脊柱炎、类风湿关节炎和HLA［J］．中华内科杂志，1983，22：2851．
［5］ Martinez-BorraJ，Gonzalez S，Lopez-VazquezA，et al．HLA-B27 alonethan B27-related class l haplotypes contributes to ankylosing spondylitis susceptibility［J］．Human lmmunol，2000，61（2）：131．
［6］ Peter J，Macardle，Robert McEvoy，et al．HLA-B27expression by flow cytometry：an analysis of 7 years quality assurance data［J］．J Immunol Methods，2000，243（1）：51．
作者单位：中国人民解放军第181医院肾脏科，广西 桂林 541000.