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【摘要】 目的 研究中国南方地区H5N1亚型人禽流感病毒血凝素基因分子特征。 方法 从Genebank中下载中国南方地区3株H5N1亚型人禽流感病毒和其他国家或地区的16株代表性H5N1亚型人禽流感病毒血凝素基因序列，利用生物信息学软件DNASTAR 5.0进行核酸同源性分析，用MEGA 3.1进行核酸和氨基酸序列比对和进化树分析。 结果 中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA蛋白的重链区和轻链区连接肽的序列为LRERRR-KR,与动物分离的高致病性H5N1亚型禽流感病毒和东南亚地区人禽流感病毒的连接肽相比，减少1个碱性氨基酸; 共有8个潜在的糖基化位点，抗原决定簇位点有其独特的特征。基因进化树表明中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因位于单一的进化簇，与动物来源的高致病性禽流感病毒HA基因同源性高。 结论 中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因分子特征一致，有其显著的独有特点。提示候鸟或其他扩散因素在高致病性H5N1亚型流感病毒HA基因的重配方面扮演了重要的作用。
【关键词】 人禽流感病毒H5N1 基因序列 中国南方
Study on the characteristic of hemagglutinin gene of 3 strains of H5N1 influenza virus isolated from southern China.
FANG Shi-song, HE Jian-fan, CHENG Xiao-wen, et al.
(Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To understand the hamagglutinin(HA) gene characteristics of human avian influenza virus H5N1 subtype isolated from southern China. Methods The 19 HA gene sequences of highly pathogenic avian influenza(HAPI) virus including 3 strains isolated from southern china and 16 strains isolated from the other regions or countries were downloaded and their genetic characteristics including sequence alighment、specific nucleic acid or amino acid site and phylogenetics were analyzed by biosoftware DNASTAR 5.0 and MEGA 3.1, respectively. Results The cleavage site of hemagglutinin of 3 strains of human avian influenza virus H5N1 subtype isolated from southern China was LRERRR-KR, with one basic amino acid deletion. There were 8 potential glycosylation sites and different antigen sites located in the HA gene, which showed specific molecular characteristic compared with other strains. Phylogenetic analysis showed that the 3 strains isolated from southern China located in one separate cluster with high homogeneity with the strain from animals. Conclusion There are coherent molecular characteristics among HA genes of 3 strain influenza virus H5N1 subtype isolated from southern China with their specific profiles. The migratory birds or other migratory factors play more important role in HA gene reassortant.
Key words：Human avian influenza virus H5N1； Gene sequence; Soutnern China
高致病性禽流感病毒H5N1亚型的爆发首先于1996、1997年［1,2］在中国华南地区发生。随后该亚型病毒迅速蔓延于越南、泰国、印尼、其他东亚国家以及世界其他国家和地区［3］，造成大量家禽死亡以及人感染高致病性禽流感病毒H5N1亚型病例。截止到2007年1月15日，全球共发生人感染禽流感疫情405例，死亡185例。在中国从2003年至今共发生人感染禽流感疫情22例，死亡14例。目前全世界对流感病毒/禽流感病毒的公共卫生意义以及对其致病性分子机制已经给予高度关注。迄今为止，从动物和人分离的H5N1亚型禽流感病毒从基因水平可以细分为几个亚型（A、B、C、D、E、Z、Z+、Y、B、W、X0-X3）［4］。自2004年以来流行的基因亚型主要以Z型为主。流感病毒血凝素基因（HA）在宿主识别、病毒毒力、抗原性变异等方面起主要作用，并且该基因核酸序列根据不同的分离地域表现出不同特征。本研究根据已公开的部分H5N1亚型禽流感病毒HA基因序列，重点分析了中国南方3株毒株的HA基因分子特征，对于了解该亚型病毒的分子流行特征、趋势和溯源具有重要的意义。
1 材料和方法
1.1 毒株 根据Genebank公布的H5N1亚型禽流感病毒HA基因序列，针对性的选择了19株毒株，其中包括中国南方地区3株高致病性禽流感病毒毒株。19株毒株的名称(检索号)分别为：1 A/chicken/Guangdong/174/04(H5N1) (AY609312)、2 A/Thailand/5(KK-494)/2004(H5N1)(AY627885)、3 A/Thailand/5(KAN-1)/2004(H5N1)(AY555150)、4 A/Vietnam/CL36/2004(H5N1)(DQ497724)、5 A/duck/Vietnam/TG-007A/2004(H5N1)(DQ099756)、6 A/Vietnam/1203/2004(H5N1)(AY818135)、7 A/CK/Thailand/1/2004(H5N1)(AY651326)、8 A/Hong Kong/213/03(H5N1)(AB212054)、9 A/Guangxi/1/2005(H5N1)(DQ371930)、10 A/duck/Fujian/9713/2005(H5N1)(DQ992820)、11 A/Anhui/1/2005(H5N1)(DQ371928)、12 A/Guangzhou/1/2006(H5N1)(DQ842489)、13 A/chicken/Indonesia/R60/05(H5N1)(AM183670)、14 A/Indonesia/CDC523/2006(H5N1)(CY014311)、15 A/bar-headed goose/Mongolia/1/05(H5N1)(AB233319)、16 A/duck/Guangxi/50/2001(H5N1)(AY585375)、17 A/WildDuck/Guangdong/314/2004(H5N1)(AY950235)、18 A/Hong Kong/156/97(H5N1)(AF028709)、19 A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)(AF148678)。
1.2 方法 利用生物信息学软件DNASTAR 5.1将19株H5N1亚型流感病毒HA基因序列转换成FASTA格式，并对HA基因1-535氨基酸区段（不包含信号肽区段）进行核酸同源性分析（保留gap）。利用MEGA 3.1对19株H5N1亚型流感病毒FASTA格式HA基因序列进行核酸序列和氨基酸序列比对并进行分子关键特征分析，然后进行基因进化树构建和分析。
2 结果
2.1 中国南方地区3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因分子特征 将19株高致病性禽流感病毒HA基因（1-535氨基酸区段）进行核酸和氨基酸序列比对和同源性分析从表1中可以看出，中国南方地区3株H5N1亚型人禽流感病毒HA蛋白分子的连接肽序列为LRERRR-KR，与动物分离的高致病性H5N1亚型禽流感病毒和东南亚地区人禽流感病毒的连接肽相比，减少1个碱性氨基酸，与中国其他人禽流感病毒的连接肽序列一致。该分子特征表明中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒均为高致病性禽流感病毒，但病毒毒力与东南亚地区的毒株可能存在差别。中国南方地区3株H5N1亚型人禽流感病毒HA蛋白分子有8个潜在的糖基化位点，分别位于第10、11、23、154、165、194、286、484位点，它们均不位于连接肽附近。在抗原决定簇位点83、86、138、140、141位点，中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒均分别是A、A、Q、T、P，与东南亚国家（不包括印度尼西亚）毒株存在差别，它们一般为A、V、Q、K、S（分析数据没有提供）。在受体结合相关位点129、175位点，中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒均分别是S，L，而东南亚国家毒株一般为L，L（M）。这说明在中国南方分离到的3株人禽流感病毒在抗原性上有自己独特的特点。而在禽流感病毒受体结合位点224-226，中国南方3株人禽流感病毒HA蛋白分子与其他动物高致病性禽流感病毒和人禽流感病毒均为QSG（分析数据没有提供）。
表1 中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA蛋白分子的分子特征（略）
Table 1 Molecular character of HA protein of 3 human avian influenza virus H5N1 subtype isolated from southern china
2.2 中国南方地区3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因进化树与核酸同源性分析 将中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因与其他16株高致病性H5N1亚型禽流感病毒和H5N1亚型人禽流感病毒HA基因进行比较，结果如图1。
图1 19株高致病性H5N1亚型禽流感病毒HA基因进化树（略）
Fig 1 Phylogenetic analysis of HA gene of 19 strain avian influenza viruses H5N1 subtype
图1结果表明，中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒HA基因在基因进化上与其他毒株存在差异。A/Guangxi/1/2005(H5N1)、A/Anhui/1/2005(H5N1)、A/Guangzhou/1/2006(H5N1)与A/duck/Fujian/9713/2005(H5N1)处于同一进化簇，并且与印度尼西亚、蒙古分离毒株（人源和禽源）同源性较高；在该进化簇中，A/duck/Fujian/9713/2005(H5N1)毒株表现出了与中国南方3株H5N1人禽流感病毒HA基因的高度同源性，核酸同源性分别达到99.2%、99.2%和98.3%。表明中国南方地区的人禽流感病毒HA基因可能与该地区动物分离到的高致病性禽流感病毒高度相关。泰国、越南分离毒株处于同一进化簇，在该进化簇中，A/chicken/Guangdong/174/04(H5N1)毒株HA基因表现出特殊的进化特征，该毒株HA基因核酸序列与A/Thailand/5(KK-494)/2004(H5N1)同源性达到100%，表明在泰国、越南进化簇中的高致病性禽流感病毒HA基因可能是与其他毒株的基因重组的结果，在这过程中候鸟或其他扩散因素可能扮演了重要的作用［3,5］。
3 讨论
至今已经发现的禽流感病毒血凝素存在16种亚型，既能在禽中造成流感流行，又能直接感染人的H5、H7和H9亚型中的一些毒株［6］。2007年分子生物学研究表明，高致病性禽流感病毒HA蛋白HA1和HA2之间的连接肽均为多个连续的碱性氨基酸（KKKR/RKKR）。另外，流感病毒毒力的高低还与连接肽附近是否有糖基化位点密切相关。在本研究中发现，中国南方3株H5N1人禽流感病毒HA蛋白在分子特征上表现出了一定的特异性，连接肽位点减少一个碱性氨基酸；抗原决定簇位点以及受体结合相关位点也表现出了与泰国、越南毒株不同的现象，在一定程度上可能与中国南方地区分离的人禽流感病毒的毒力以及宿主易感性存在一定的作用关系。
从19株高致病性H5N1亚型禽流感病毒和人禽流感病毒HA基因进化树以及核酸同源性分析来看，中国南方3株H5N1亚型人禽流感病毒处于同一进化簇，并且与动物高致病性禽流感病毒HA基因同源性较高，而泰国、越南毒株处于同一进化簇［7］，该簇与中国南方3株毒株HA基因存在一定差异，而与A/chicken/Guangdong/174/04(H5N1)毒株HA基因同源性高。说明中国南方分离的H5N1亚型人禽流感病毒HA基因表现出了一定的特异性，也表现出了与动物高致病性禽流感病毒的高度相关性。在该研究中也发现不同国家或地区动物高致病性禽流感病毒HA基因和人禽流感病毒HA基因存在重配的可能，并且候鸟或者其他扩散因素可能发挥着重要的作用。
只有充分了解和掌握人禽流感病毒HA基因的分子特征和基因进化关系，才能更好的实现预防和控制，本研究在这一领域进行了初步的探索和研究，希望对以后的工作有所裨益。
【参考文献】
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作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020.