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【摘要】 目的 研究头孢呋辛钠的氨解机理和产物。 方法 运用半制备型HPLC分离提纯降解产物,以波谱方法(UV,IR,HRFABMS,EIMS, ESIMS,1HNMR,13CNMR,1H-1HCOSY,HMQC,HMBC)对其进行结构确证。 结果 得到头孢呋辛钠的氨解产物并推测了降解机理。 结论 该氨解产物为首次得到。
【关键词】 头孢呋辛钠 氨解 波谱方法
Investigation into the aminolysis of cefuroxime sodium.
CHEN Zhzo-kun, HU Chang-qin,SHEN Yong-jia.
(Hainan Institute for Drug Control, Haikou 570216, Hainan; National Institute for Drug and Bioproduct Inspection, Beijing 100050, P. R. China)
Abstract:Objective To study the mechanism of aminolysis and degradation product of cefuroxime sodium. Methods The semi-preparative reversed phase HPLC was used to separate and purify constituent, the structure was elucidated by UV,IR,HRFABMS,EIMS, ESIMS,1HNMR,13CNMR,1H-1HCOSY,HMQC and HMBC spectral analysis. Results A aminolysis product has been isolated and a hydrolysis mechanism has been supposed. Conclusion The product was obtained for the first time.
Key words:Cefuroxime sodium; Aminolysis; Spectral analysis
头孢呋辛钠是世界上广泛使用的第二代头孢菌素类抗生素[1],因为它抗菌谱广、专属性强、副作用小,越来越得到人们的重视[2~5]。然而,在酸、碱、水、温度等因素影响下,其结构中最具有生物活性和化学反应性的β-内酰胺环易发生相应的降解,因此,研究头孢呋辛钠以及该类抗生素的降解途径和降解产物结构对于它们的生产和临床应用都具有非常重要的意义。本文在自由氨基参与的碱性条件下,用波谱分析方法(UV,IR,HRFABMS,EIMS, ESIMS,1HNMR,13CNMR,1H-1HCOSY,HMQC,HMBC)对其降解途径和降解产物结构进行了研究。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药 岛津LC-10AT型液相色谱仪,SPD-M10Avp 检测器; Heto FD2.5 冷冻干燥机;Agilent 8453紫外分光光度计;HITACHI 270-30红外分光光度计;Finigan LCQ DECA XP plus质谱仪;Micromass Autospec-Ultima-TOF 质谱仪;Varian INOVA-500 核磁共振仪。
1.2 方法
1.2.1 制备色谱条件制定和降解实验分离 Waters公司C18半制备柱(μ BONDAPAKTM C18),水为流动相,流速2ml·min-1,检测波长254nm,进样量100μl。取头孢呋辛钠约200mg,加氨-氯化铵缓冲液(pH10.0)20ml溶解,置100℃烘箱中加热0.5h后取出,快速冷却至室温,过滤,滤液供液相色谱制备分离。
1.2.2 化合物色谱纯度分析 分别用C6及C18分析柱,流动相Ⅰ,Ⅱ(Ⅰ:水-乙腈(95:5);Ⅱ:四丁基溴化铵乙腈溶液(0.8%)-磷酸钾缓冲液(0.1mol·L-1,pH为7.0)-柠檬酸缓冲液(0.1mol·L-1,pH为5.0)-水(400:44:4:552))两种体系对其进行了分析。
1.2.3 结构分析 以Agilent 8453紫外分光光度计,HITACHI 270-30红外分光光度计,Finigan LCQ DECA XP plus质谱仪,Micromass Autospec-Ultima-TOF 质谱仪,Varian INOVA-500 核磁共振仪进行结构分析。
2 结果
2.1 降解与分离 头孢呋辛钠(CHEIL JEDANC Corporation,批号:2001,纯度:含93.5%的头孢呋辛)氨解产物经液相色谱制备分离,色谱图见图1。
图1 制备色谱图(略)
Fig 1 Preparative HPLC chromatogram
1. 氨解产物(Aminolysis product)
2.2 化合物色谱纯度 用C6及C18分析柱两种体系对上述产物进行分析,结果表明所制备的化合物经色谱纯度分析是纯品。见图2。
2.3 化合物结构数据 制备产物为淡黄色粉末,UV(H20)λmax nm(ε×104):268(1.20);IR(KBr cm-1):3400,1660,1070,950,800;ESIMS [M+H]+ 准分子离子峰m/z 253;HRFABMS 显示分子离子峰 m/z 252.09,确定分子量为C10H12N4O4(calc. 252.09),主要碎片峰 m/z 236.07,确定分子量为C10H10N3O4(calc. 236.07);EIMS m/z(%) 252(M+),178(100),93(52),94(51),100(18),221(12);234(8),235(15);1HNMR(500 MHz DMSOd6) δ:4.02(3H,s),6.67(1H,dd,J=1.5 Hz,2.0 Hz),7.15(1H,d,J=7Hz),7.26(1H,d,J=3Hz),7.84(1H,s),5.60(s),6.29(s),8.91(s);13CNMR(500 MHz DMSOd6) δ:167.50(s,C-7),160.21(s, C-5),144.53(s, C-1),142.59(s, C-4 or C-10),142.49(s, C-4 or C-10), 138.44(s, C-9) ,119.01(s, C-3),112.16(s, C-2), 99.93(s,C-8), 63.07(s,C-6)。
图2 纯度分析色谱图(略)
Fig 2 Chromatograms of purity analysis
A. C18柱,流动相Ⅰ(C18 column,mobile phase Ⅰ);
B. C6柱,流动相Ⅱ(C6 column,mobile phase Ⅱ);
1. 氨解产物(Aminolysis product)
2.4 结构解析 UV(H20)λmax nm:268处的最大吸收峰,显示了共轭羰基及呋喃环的基本骨架;IR光谱显示有νO-H,νN-H(3400 cm-1),酰胺νC=O(1660 cm-1),νC-N和νC-O(1 200~1 000cm-1),δC=C-H(950,800 cm-1)等官能团的特征吸收频率;ESIMS和HRFABMS确定了产物分子式为C10H12N4O4,对HRFABMS谱中裂解的m/z 236碎片峰和EIMS谱中m/z 235碎片峰分析,发现该化合物存在末端氨基。同样,EIMS谱中m/z 234碎片峰推测存在末端羟基。其余EIMS碎片峰推测见图3。
图3 EIMS碎片峰推测(略)
Fig 3 Diagnostic EIMS fragment ions(m/z)
1H-1HCOSY显示降解物结构中仅存在6.67(1H,dd,J=1.5 Hz,2.0 Hz), 7.26(1H,d,J=3Hz),7.84(1H,s)之间的氢氢相关,其中,δH 6.67和δH 7.84,δH 7.26两者均相关,而δH 7.84,δH 7.26之间并无相关联系,同时δC 144.53(C-1),142.59(C-4),119.01(C-3),112.16(C-2)信号结合两者的HMQC,HMBC谱,可推测它们为呋喃环结构。通过HMQC谱可知δH 7.17对应的碳信号为烯碳δC 138.44,另一烯碳δC 99.93为季碳,且δH 7.17和δC 167.50和 99.93有远程相关关系,结合13CNMR 谱可推测7-C,8-C,9-C的信号分别为δ:167.50,99.93,138.44。在HMQC谱中δH 5.60,6.29,8.91信号均无对应的碳信号,且随着重水的加入,峰面积慢慢变小,甚至峰消失,提示均为活泼氢,结合1HNMR谱推测其分别为-OH,-NH2,-CONH。
3 讨论
3.1 经波谱分析方法鉴定,降解物结构见图4
图4 头孢呋辛钠氨解产物(略)
Fig 4 Aminolysis product of cefuroxime sodium
3.2 长期以来,人们认为在有自由氨基的碱性环境中,头孢菌素会发生类似于青霉素氨解的在β-内酰胺环上的催化亲核氨基反应,产生与人体中过敏反应有关的头孢菌素氨基化合物[6],但对降解途径的认识大多为β-内酰胺环的碱性水解开环和C-3位侧链的水解,根据文中所确证的头孢呋辛钠乃至头孢菌素的新降解产物,我们推测出如下的降解机理,见图5。
图5 头孢呋辛钠氨解(略)
Fig 5 Aminolysis of cefuroxime sodium
从图5中我们可以看到,在氢氧根离子攻击下,C-3位侧链酯基水解,β-内酰胺环开环,OC—N键断裂,产生中间体Ⅰ。加热后,Ⅰ的六元环破裂,生成了中间体Ⅱ,其与溶液中自由氨基发生亲核反应,且N-C键断裂,最终生成了较为稳定的氨解产物。
【参考文献】
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作者单位:海南省药品检验所,海南 海口 570216; 中国药品生物制品检定所, 北京 100050; 华东理工大学,上海 200237.