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【摘要】 目的 对广州地区2006年流行的登革病毒5′末端非编码区的基因进行分子流行病学分析。 方法 针对病毒5′末端非编码区设计引物，进行RT-PCR反应，将阳性结果测序并绘制基因树。 结果 在检测的78份血清中，检测出阳性血清23份，共获得4个代表性序列。 结论 通过绘制基因树分析，不支持登革病毒已本地化。登革热病例的输入对登革热的预防和控制提出了巨大挑战，及时发现和控制传染源，对登革热的预防和控制有重要意义。
【关键词】 登革病毒 基因 序列分析
Sequence analysis of dengue virus isolated in Guangzhou in 2006.
JIANG Li-yun, WU Ye-jian, LIU Yuan, et al.
(Guangzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 510080, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To analyze the gene of 5′un-scripted region of dengue virus isolated in Guangzhou in 2006. Methods A pair of primers aiming at the 5′un-scripted region were designed. The positive products were sequencely analyzed by RT-PCR and then phylogenetic tree was drawn. Results There 78 serum samples were tested and 23 were positive. Four representative sequences were identified. Conclusion There is no evidence show that dengue virus has been localized in Guangzhou.The virus seems to be brought back by travelers from other countries. Thus the rapidly discover and control sources of infection is of fundamental importance for control of dengue fever.
Key words：Dengue Virus; Gene; Sequence analysis
登革热是流行于热带和亚热带地区的一种虫媒传染病,由登革病毒所致。在我国主要流行于广东、海南、广西、福建等地区，通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。广州曾在2002年发生登革热大流行，而后几年则仅有散发病例。2006年，广州地区发生小规模暴发，通过临床确诊或实验室确诊的登革热病人共有774例。
登革病毒基因组可分为5′末端非编码区、病毒结构蛋白编码区、病毒非结构蛋白编码区，以及3′末端非编码区4个部分。其中，5′与3′末端非编码区各有一保守序列，且反向互补，病毒RNA分子的环化部分可能作为病毒RNA酶的识别部位，使该酶同时与RNA分子的5′和3′末端结合，用于转录正链和负链RNA。5′末端非编码区的缺失将导致病毒复制受抑制。在本实验中，针对5′非编码区设计通用引物D1和D2，从病人血清中提取病毒RNA，进行RT-PCR，并对产物测序，将序列进行比较，绘制基因树。
1 材料与方法
1.1 标本 广州地区2006年3～10月登革热高发期间，采自登革热流行现场以及传染病医院送检的疑似病人血清标本,共计78份。
1.2 材料和仪器 QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取登革热病毒RNA，TaKaRa One Step RNA PCR Kit 进行RT-PCR扩增，QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）挖胶回收，Eppendorf Mastercycler 梯度PCR仪，Bio电泳仪。
1.3 引物序列 D1 ATATGCTGAAACGCGCGAGAAA，D2 GACATTGACTGTTGGTGCAA。
1.4 RT-PCR 用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取登革病毒RNA，加入引物D1和D2，用TaKaRa One Step RNA PCR Kit 进行RT-PCR扩增，反应条件 42℃ 1h，94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 3min，循环30次， 72℃ 7min。
1.5 电泳及测序 将RT-PCR反应产物加入1%的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色后在紫外光下观察，阳性条带为500bp。
1.6 基因序列同源性分析及基因树绘制 将得到的样品测序结果在BioEdit中相互比较，在GenBank中搜索相似序列，并与标准株Thai01，Myanmar01，Cambodia98，ZJ01，Japan88，westpac，Arg00，Par00，Brazil97，singapore，GZ02，GZ80绘制基因树。
2 结果
2006年期间，实验室用RT-PCR检测不同病人血清标本78份，检测出阳性23份，阳性率为29.49%。其中，1份为登革热III型（GZ06/71），在GenBank中搜索发现，GZ06/71的序列与2004年印度尼西亚分离得到的序列最为相近，相似率为98%。登革病毒Ⅰ型株22份，在BioEdit中比较得出3种代表序列，分别标号为GZ06/1707（8株），GZ06/2620（13株），GZ06/4525（1株），三株相似率及与标准株绘制的基因树见表1和图1。
3 讨论
2006年期间，广州地区出现了散发性的登革热流行。在病人血清中，检测出登革Ⅲ型和登革Ⅰ型两种型别的毒株，获得4个代表性序列，分别为GZ06/71、GZ06/1707、GZ06/2620和GZ06/4525。
表1 3种代表序列相似率比较（略）
Table 1 Comparison of the similarity rates
图1 登革病毒基因树图（略）
Fig 1 Phylogenetic tree of Dengue Virus
GZ06/71患者是2006年广州发现的第一例登革热病人。患者3月初从印度尼西亚回国后不适，遂入院检查。从病人血清中分离扩增得到的病毒序列与2004年印度尼西亚分离的毒株最为相近。据报导［1］，2004年印度尼西亚登革热流行的优势毒株为Ⅲ型。并且，在历次印度尼西亚登革热流行中，登革Ⅲ型都为优势株［2］。因此，无论是流行病学还是实验室诊断结果，都支持这是一例输入性登革热病例。由于发现及时，并对该病人采取隔离措施，病人居住区灭蚊，所以该病毒株未造成传染及流行。在随后发生的登革热病人血清中，均未检出登革Ⅲ型病毒核酸。
GZ06/4525病人为一外籍人士，并且在发病前几日从国外到达广州。对基因树分析发现，GZ06/4525与Arg00，Par00和Brazil97的同源关系最为相近。通过核苷酸序列比较，与Brazil97的相似率达到了98%。根据登革热的潜伏期为2.5～15d，以及在该病人之后未有相同或近似序列检出，同样支持输入性登革热的结论。在得到的登革Ⅰ型株中，优势株为GZ06/1707（8株）和GZ06/2620（13株）。在约500bp长的序列中，两株之间仅有9个碱基的差别。根据基因树发现，两株病毒与广州2002年流行的登革热病毒株的同源性存在较大差别。参考以往的报导，广州地区登革热流行多呈爆发、输入性流行的特征,至今仍无证据表明已成为地方性［3］。我们可以初步排除该两株病毒是由2002年的毒株进化而来。并结合GZ06/71和GZ06/4525 2例有确切输入源但未造成流行的病例推测，是否由于未及时发现和隔离最初从国外归来的已感染登革热的病人，因而造成登革热的扩散和流行。有数据显示，广州旅行者的旅行地以东南亚地区为主，由于这些地区气候炎热，虫媒活跃，是登革热流行的地区，加之旅途疲劳，机体抵抗力下降，使旅行者感染的机会增大，归来后造成登革热传染及流行［4］。
综上所述，通过2006年登革热流行的情况可以发现，由于广州位于沿海地区，登革热的输入对登革热的预防和控制提出了巨大挑战。在2006年发现的有确切输入源的两例登革热病人GZ06/4525和GZ06/71，由于发现及时控制得当，均未引起登革热流行。而引起流行的登革热毒株GZ06/1707和 GZ06/2620，都未发现确切的输入源，病人均为本地感染。因此，及时发现和控制传染源，加强对外来特别是疫区归来人员的监测，对登革热的预防和控制有重要意义。
【参考文献】
［1］ Suwandono A, Kosasih H, Nurhayati, et al.Four dengue virus serotypes found circulating during an outbreak of dengue fever and dengue haemorrhagic fever in Jakarta, Indonesia, during 2004［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg， 2006，100(9):855～862.
［2］ Nono c. Sukri, Kanti Laras, Toni Wandra, et al.Transmission of epidemic dengue hemorrhagic fever in easternmost Indonesia［J］. Am. J. Trop. Med. Hyg, 2003,68(5):529～535.
［3］ 罗会明，何剑峰，郑夔，等.广东省1990～2000 年登革热流行病学分析［J］.中华流行病学杂志，2002 ，23（6）：427～430.
［4］ 陈国雄，何耀明，吴烽.广州出国旅行者感染登革热风险性的评估［J］.中国国境卫生检疫杂志，2003，26（增刊）：13～14.
作者单位：广州市疾病预防控制中心,广东 广州 510080.