氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中DNA损伤的研究

【摘要】  目的 探讨氯化镉恶性转化人支气管上皮（16HBE）细胞中DNA断裂损伤情况,进一步揭示氯化镉的致癌机制。 方法 采用单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)检测氯化镉恶性转化人支气管上皮细胞中非转化16HBE细胞、氯化镉恶性转化第15代、第35代细胞及成瘤细胞的DNA链断裂情况。 结果 与非转化16HBE对照细胞比较,氯化镉恶性转化16HBE第15代、第35代细胞和氯化镉诱发16HBE恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞的DNA损伤率分别达22.00％、46.75.00％和49.00％,明显高于非转化16HBE细胞的4.75％损伤率（P<0.001）,三种细胞彗星尾长也显著大于非转化16HBE细胞（P<0.001）。 结论 细胞DNA损伤可能是镉化物分子致癌的重要机制。

【关键词】  氯化镉 人支气管上皮(16HBE)细胞 DNA损伤 肿瘤

　　Studies on the DNA damage in transformed bronchial epithlial cells induced by cadmium chloride.

　　ZHOU Zhi-heng, LEI Yi-xiong, WANG Cai-xia, et al.

　　(School of Public Health and General Medicine, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510100, China)
   
　　Abstract：Objective  To study DNA damage in the transformed human bronchial epithelial(HBE) cells induced by cadmium chloride( CdCl)and further elucidate the relative potential carcinogenesis of CdCl2.  Methods  The DNA damage of the normal 16HBE cells, CdCl2 transformed 16HBE cells of 15th and 35th passage and the tumorigenic cells of nude mice were determined by single cell gel electrophresis (SCGE) assay.  Results  The DNA damage rate in the 15th,35th passage cells and the tumorigenic cells of nude mice cells treated with CdCl2 were 22.00％，46.75％ and 49.00％，while the DNA damage rate of the non-transformed 16 HBE was 4.75％, showing significant difference（P＜0.001).The tail length of the DNA comet in the 15th and 35th passage cells and the tumorigenic cells of nude mice treated with CdCl2 were longer than the non-transformed 16HBE cells （P＜0.001）.  Conclusion  DNA Damage may be a possible carcinogenic mechanism for Cadmium and its compounds.
   
　　Key words：Cadmium chloride (CdCl2); Human bronchial epithelial (16HBE) cells; DNA damage; Cancer

　　镉及其化合物是一类工业毒物和环境污染物，可在职业和环境中长期存在［1］。研究表明，镉可致动物和人类多种肿瘤如肺癌、肾癌、前列腺癌和胰腺癌等，特别是从事冶炼、焊接，以及煅烧操作的高危人群［2～4］。因此，1993年，镉已被国际癌症研究机构(IARC)列为第一类致癌物［5］。但其分子致癌机制仍未完全阐明。过去的研究表明：镉及其化合物可引起DNA链断裂、DNA链交联、染色体畸变等，然而，这些遗传损害是否也存在于镉转化人细胞中，未见报道。我们实验室在前期的研究中建立了氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化模型［6］，本实验的目是探讨氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化中是否存在DNA损伤现象，进一步揭示氯化镉的致癌机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  氯化镉体外细胞转化模型构建［6］  人支气管上皮细胞系由广州市呼吸疾病研究所徐军教授馈赠，氯化镉（CdCl2）为广州试剂厂出品。16HBE细胞以含小牛血清10%（V/V）的MEM培养液培养，至细胞处于指数生长期后加入终浓度15μmol/L的CdCl2，作用时间为24h，每隔12d处理1次，共处理10次，细胞培养至第35代，经细胞形态学观察，软琼脂集落分析及裸鼠成瘤试验，证实CdCl2具有恶性转化人支气管上皮的作用。

　　1.2  主要仪器和试剂  OLYMPUS荧光显微镜(日本);DYY27型转移电泳仪(北京六一仪器厂);磷酸盐缓冲液(PBS,NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L,KH2PO4 0.2g/L, Na2HPO4·2H2O 1.56g/L);裂解液(2.5mol/L NaCl,100mmol/L Na2-EDTA,10mmol/L Tris pH 10)用前加入1.0% TritonX-100和10%二甲基亚砜;电泳液(0.3mol/L NaOH,1mmol/L Na2-EDTA pH13);中和液(0.4mol/L Tris pH 7.5);DNA裂解液(1M Nacl 40ml、0.5MTris（pH8.5）20ml、20％SDS 2ml、0.5MEDTA 2ml，200ml ddH2O);用无钙镁的PBS配制浓度为1.0%正常熔点琼脂糖和0.7%低熔点琼脂糖。

　　1.3  细胞准备  取前述非转化16HBE细胞, 氯化镉恶性转化16HBE第15代、第35代细胞和接种裸鼠成瘤细胞常规培养，待长满后，消化细胞并用PBS液洗涤3次，再用PBS液洗配成1×106/ml的细胞悬液。

　　1.4  单细胞凝胶电泳  参照Singh等［7］的方法进行单细胞凝胶电泳(SCGE)。先取正常熔点琼脂糖100μl,铺于磨沙载玻片上,冷却后加上80μl细胞悬液(30μl)与低熔点琼脂糖(50μl)的混合液,低熔点琼脂糖的温度应在37～40℃时混合,以免过高的温度对细胞造成损伤,混合后盖上盖玻片,每种细胞制片4张,4℃冷却5～10min后除去盖玻片,放入预冷的裂解液中裂解1h 45mim，放入碱性电泳液中平衡20min,使其解螺旋,然后在25V, 300mA条件下电泳30min。电泳结束后放入中和液中和3次,每次5min。用50μl EB (0.5mg/L)染色。以上所有步骤均在黄、红色灯光下或暗处进行,以免DNA额外破坏。在荧光显微镜下(515nm的激发波长)观察结果，每种细胞随机计数100个细胞DNA，记录彗星细胞数，用目镜测微尺对每张玻片随机测量20个彗星细胞（每种细胞共测量80个彗星细胞）的总长和头长。彗星尾长=总长-头长，计算平均尾长，并用CANNON数码相机在10×20和10×40放大倍数下进行摄片。

　　1.5  统计学处理  运用SPSS12.0统计软件建立数据库，将实验数据输入数据库，彗星率的比较用χ2检验，各组平均尾长的比较用单因素方差分析（ANOVA），多个样本均数间的多重比较用q检验（Student-Newman-Keuls q检验）。

　　2  结果
   
　　在荧光显微镜下，细胞DNA呈橘红色，未断裂DNA只有完整的头部，断裂DNA形成拖尾巴。氯化镉恶性转化16HBE第15代细胞、第35代细胞和氯化镉诱发16HBE恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞的DNA损伤率明显高于非转化16HBE细胞的损伤率（χ2第15代细胞=51.365,P=0.000;χ2第35代细胞=184.525，P=0.000;χ2裸鼠成瘤细胞=199.270，P=0.000），彗星尾长也明显大于非转化16HBE细胞（P第15代细胞=0.000,P第35代细胞=0.000、P裸鼠成瘤细胞=0.000），见表1。

　　表1  16HBE细胞、氯化镉转化第15代、32代细胞和裸鼠成瘤细胞SCGE检测结果（略）

　　3  讨论
   
　　肿瘤的发生发展是内外环境因素导致的涉及多阶段的复杂过程，这些过程中往往又与机体内在遗传因素和环境致癌因素的长期累积性损伤作用有关。镉化合物的致癌也涉及到多种直接或间接的遗传损害。目前普遍认为镉是一种弱致突变剂,其遗传毒性主要表现为染色体畸变和DNA损伤。研究表明，镉可以引起DNA损伤，Gaspar Banfalvi等［8］用随机引物寡聚核苷酸合成(ROPS)方法，氯化镉染毒后，在整个细胞循环中，单链断裂片断数目比对照组高10～40倍。镉可使彗星尾长增加［9］，K.Dana Devi 等［10］的研究表明，彗星尾长与镉剂量(0.5～128mg/kg)之间存在剂量依赖关系。然而，未见镉转化人支气管细胞中DNA损伤方面的研究报道。本研究中，观察到氯化镉恶性转化16HBE第15代细胞（损伤率5％～20％：中度损伤）、第35代细胞（损伤率40％～95％：高度损伤）和接种裸鼠成瘤细胞（40％～95％：高度损伤）与对照组非转化16BHE细胞（损伤率＜5％：无度损伤）相比各指标差异均有显著性，而且第15代细胞与第35代细胞和接种裸鼠成瘤细胞性也存在统计学差异，这说明氯化镉可引起DNA断裂损伤,且损伤程度与恶性转化程度有关性，提示细胞DNA损伤可能是镉化物分子致癌的重要机制之一。
   
　　国内外对金属镉致癌、致细胞恶变的研究多采用啮齿类动物细胞系，人细胞用于镉化合物的恶性转化活性研究的报道很少。目前国内外尚无关于镉化合物恶性转化人支气管上皮细胞过程中镉对DNA损伤的相关研究报道。本文所用细胞为永生化的16HBE恶性转化后的细胞模型,比通常用动物细胞或人成纤维细胞更为合理,可较好的避免种属间及组织间差异,此外人类肿瘤大多数起源于上皮细胞,用以上皮细胞来研究肿瘤发生机制更恰当。

【参考文献】
  　　［1］ Diao WP,Ni WZ, Ma HY,et al.Cadmium pollution in paddly soil as affected by different rice (Oryza sativae L.)cultivars［J］. Bull Rnviron Contam Toxicol, 2005,59(2):519～523.

　　［2］ Fay RM, Mumtaz MM. Development of a priority list of chemical mixture occurring at 1188 hazardous waste sites, using the HazDat database［J］. Food Chem. Toxicol,1996,34:1163～1165.

　　［3］ Aylett BJ. The chemistry, biochemistry and biology of cadmium, Elsevier, North-Holland, New York, 1997.

　　［4］ Waalkes MP, Coogan TP, Barter RA. Toxicological principles of metal carcinogenesis with special emphasis on cadmium［J］. Crit Rev Toxicol, 1992, 22: 175～201.

　　［5］ IARC. Beryllium, cadmium, mercury and exposures in the glass manufacturing industry, Lyon, France［J］. International Agency for Research on Cancer, 1993, 58: 119～238.

　　［6］ 王敏，魏莲，雷毅雄.氯化镉诱发人支气管上皮细胞系恶性转化［J］. 中国职业医学，2005，（6）：56～57.

　　［7］ Singh NP, McCoy MT, Tice RR, et al. Asimple technique for quantitation of low levels of DNA dmage in individual cells［J］. Exp Cell Res, 1988, 175:184～191.

　　［8］ Banfalvi G, Littlefield N, Ass B,et al.Effect of cadmium on the relationship betteen replicative and repair DNA synthesis in synchronized CHO cells［J］. Eur.J.Biochem, 2000,267:6580～6585.

　　［9］ Kasuba V, Rozgaj R, Saric MM,et al. Evaluation of genotoxic damage of cadmium chloride in peripheral blood of suckling Wistar rats［J］. J.Appl.Toxicol,2002,22: 271～277.

　　［10］ Devi KD, Banu BS, Mahboob M,et al. In vivo genotoxic effect of cadmium chloride in mice leukocytes using comet assay［J］. Teratog Carcinog Mutagen,2001;21(5):325～333.

作者单位：广州医学院公共卫生与全科医学学院,广东 广州 510182; 广州医学院附属市一医院血液科，广东 广州 510180.