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【摘要】 目的 本文对胶乳增强免疫透射比浊法定量测定抗“O”进行方法学评价。方法 定量测定抗“O”，并对其线性范围、重复性、相关性实验、干扰实验及试剂稳定性加以评价。结果 线性范围为20～800U／ml；高、中、低三种浓度的抗“O”批内CV分别为1.74％、1.87％、 1．96％；批间CV分别为2．1％、2．92％、3．52％；平均回收率为99.85％。结论 胶乳增强免疫透射比浊法定量测定血清中抗“O”含量，其线性范围宽、重复性好、特异性高、干扰小、操作简便快速，具有较高的临床应用价值。
【关键词】 胶乳增强免疫透射比浊法；抗“O”(ALSO)；测定
以往检则ASO多采用乳胶凝集法，该方法灵敏度不高，重复性欠佳，受实验环境等因素影响较在，不能满足临床对ASO定量的要求。我们对胶乳增强免疫透射比浊法定时测定抗“O”进行方法学评价，具有较好的临床应用价值。
1 材料与方法
1.1 试剂
由北京科美东雅生物技术有限公司提供批号为：Lot：060905。
1.2 仪器
日立7600全自动生化分析仪。
1.3 检测对象
正常对照组：健康体检血清30例，年龄5～70岁之间；明确诊断为风湿性疾病患者血清50例，年龄在5～70岁之间；未明确诊断但ASO含量增高的患者血清20例。在进行各组ASO含量检测后，收集分装，并冷冻保存备用。
1.4 方法
1.4.1 测定原理
利用抗原抗体特异性反应原理测定血清中ASO含量。
1.4.2 主要参数
方法：终点法波长：540nm试剂及样本比例：试剂i1 800μl、试剂ii 200μl、标本20μl。反应时间5min。
2 实验和结果
2.1 线性范围
配制ASO浓度为1 140U/ml的标准液，与生理盐水比例混合产生20U/ml， 200UIml、400Ulml,800UIml,1 140U/ml 5个浓度。结果显示在20～800U/ml内呈线性。
2.2 重复性实验
取低、中、高3种浓度的ASO血清，作批内和批间实验。结果见表1。表1 ASO的重复性实验结果组别批内xSCV(略)
2.3 回收实验
把ASO含量为463U/ml的血清分成4份，分别加入浓度为57U/ml、142．5U/ml、285U/ml和560U/ml的4个AS0标准液，按原血清2ml，加入标准液0．1ml的比例混和，回收率分别为100．3％，99．8％、99．2％、100．1％，总平均回收率为99．85％。其结果与回收率见表2。表2 回收实验测定结果项目加入样本
浓度(略)
2.4 相关性实验
选取50例患者血清，先用乳胶凝集法检测，其中42例为阳性，8例为阴性：再用免疫透射比浊法检测，其中48例为阳性，2例为阴性。通过配对χ2检验，两种方法检测ASO的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且乳胶法检测的42例阳性患者血清比浊法检测全部为阳性，且另6例比浊法检测阳性的标本均值为238.5±29.71，与正常人相比差异有统计学意义(t检验P<0．05)，表明免疫透射比浊法对AS0的检出率比乳胶凝集法高。
2.5 干扰实验
2.5.1 溶血的干扰
取末溶血的标本，测定ASO值，然后用物理方法使标本溶血，离心取上清液，用血常规 仪检测出Hb含量为13.5g/L，再次检测，结果显示Hb为13.5g／L的血标本对AS0的检测有2.2％的干扰，而Hb在10g／L以下，即轻微的溶血对ASO的测定无明显于扰。
2.5.2 脂血的干扰
用乳糜血标本，其中含甘油三脂浓度为14mmol/L，先对其测定ASO 3次取平均值，然后加入一定量特定浓度的ASO标准液，测定3次取平均值进行计算比较，结果显示此浓度的乳糜血对ASO的检测无明显干扰，此时检测标本中甘油三脂的含量为12mmol／L，因此可以认为一般的脂血对ASO的测定不会有干扰。
2.5.3 黄疸的干扰
在ASO 333μmol／L标准液中加入等量浓度为600μmol／L的总胆红素标准液，再测定ASO理论值166.5U/ml,ASO实测值167U/ml,回收率100.3%,胆红素浓度值300U/ml,黄疸血清对ASO的检测无明显干扰。
2.5.4 类风湿因子(RF)的干扰
在ASO浓度333U／ml标准液中加入2份浓度为450U／ml类风湿因子的标准液，测得ASO结果为112.3U／ml,显示浓度为300U/ml风湿因子对ASO的检测有1.2％的干扰，所以认为一般浓度的RF血清对ASO的检测无明显干扰。ASO理论值111U/ml,ASO实测值112.3U/ml,回收率101.2%,类风湿浓度值300U/ml。
2.6 试剂稳定性
将9份ASO-I剂与1份ASO-II试剂混合即成工作液，置于2～8℃试剂箱，用来测定两种浓度的ASO质控液，测定30d，结果CV<5%,说明试剂在2～8℃可稳定30d。
3 讨论
抗“O”主要是由A组β溶血性链球菌(GAS)感染机体后,体内针对其抗原溶血素O产生的相应的抗体，此抗体即为抗链球菌溶血素O(ASO)［1］，简称抗“O”。抗“O”没有保护机体的作用［2］，但检测抗“O”值增高提示有过溶血性链球菌感染,可以作为溶血性链球菌感染的间接证据，以及对各种风湿性疾病的预防、诊断、治疗和疗效观察具有重要意义。抗“O”常在GAS感染1wk后开始升高，3～6wk后达到高峰，在6～8wk后开始下降直至逐渐恢复正常［3］。此种抗体水平显著增高与活动性风湿性疾病密切相关，持续存在或水平下降，则提示疾病为非活动期或恢复期，多次检测抗“O”水平对临床的动态监测有重要意义。
以往检测ASO多采用乳胶凝集法，且此方法至今在许多医院仍被采用。然而该方法灵敏度不高，重复性欠佳，受环境及个体差异等影响因素较大，且不能定量［4］，不能满足临床对 ASO定量的要求，随着检验医学的发展，该方法己逐渐被免疫比浊法所取代。
免疫比浊法、乳胶凝集法和ELISA一样存在免疫学中的抗原或抗体过剩引起的钩状效应，即前带或后带现象。为了防止和尽量减小钩状效应的影响，对高出线性范围以外的标本可以进行前稀释。但反应的测定范围依赖于样品试剂比，减少样品量可提高测定范围，但会相应的降低反应的灵敏度，有时也会导致Aso抗体含量过低造成抗原绝对过量，影响测定结果的准确性［5］。因此务实验室应根据自己的不同准确设置相应的参数，且根据标本浓度的不同对其进行不同比例的稀释，以尽量减少各种误差影响，确保测定结果的可靠性。
本实验较好的把胶乳增强免疫透射比浊法和生化分析仪结合在一起，定量检测血清中 ASO含量，其特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，自动化程度高，操作简便快速。与胶乳凝集法半定量测定比较，具有快速、简便、准确、干扰小的优点。从实验可以看到，Hb≤10g／L，甘油三脂≤12．5mmol／L，胆红素≤333μmol/L时对ASO的测定无明显干扰。相关实验表明免疫比浊法测定ASO的检出率比乳胶法高。完成一次测试只需要10min左右，本法准确度和精密度高，批内CV<1．96％，批间CV／<3．5％，平均回收率为99．85％。
【参考文献】
［1］贾向新，何云荣，丁旭．ASO滴度对临床诊断价值探讨［J］.白求恩大学学报，1996，22(2)：156．
［2］刘李兴福，张妮.急性风湿热诊断的相关问题［J］.临床内科杂志，2005，LO(22)：652～654．
［3］高路，袁越．链球菌感染后风湿热和风湿性心脏病［J］.临床儿科杂志，2006，24(6)：461～463．
［4］张颖，王艾丽，江舟，等．三种检测抗链球菌溶血素方法的比较［J］.医学研究生学报，2001，4(14)：54～55.
［5］刘忠民，高月亭，陈涛．自动生化分析仪器自动识别免疫比浊分析中的钩状效应［J］.现代临床医学生物工程学杂志，2002，6(4)：253．