山苦茶提取物对动脉粥样硬化大鼠血管内皮功能的影响

【摘要】  　　目的 探讨山苦茶提取物(Mallotus furetianus)对动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）大鼠血管内皮功能的影响。方法 梯度浓度稀释山苦茶B、D，与DDPH反应，测自由基清除率及其EC50。一次性给大鼠腹腔注射VD3 70万U/kg，高脂饮食，建立AS模型，并预防性给予山苦茶B、D处理。9周后处死大鼠，取血清测定SOD、NOS、MDA。迅速取出胸主动脉，制成宽3mm的主动脉环，保留内膜，并测定其内皮依赖性舒张能力。结果 山苦茶可以清除自由基（山苦茶D >维生素C >山苦茶B），并可明显降低AS大鼠血清MDA水平，提高NOS、SOD活性，增强内皮依赖性血管舒张能力。结论 山苦茶B、D增加AS大鼠内皮依赖性血管舒张能力，可能与增强NOS活性、清除自由基、提高机体抗氧化能力有关。

【关键词】  山苦茶；动脉粥样硬化；抗氧化；自由基

　　Effects of extracts of Mallotus furetianus on endothelial function of artery in atherosclerotic rats.

　　LIU Yue-li, WU Hai-tao, WANG Li-qun, et al.
　
　　Department of Pharmacy, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan,  P.R. China
   
　　Abstract：Objective  To investigate the effects and mechanism of extract of Mallotus furetianus on endothelial function of artery in atherosclerotic rats.  Methods  The ability in clearance of 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical (DDPH). VD3 by Mallotus furetianus was observed and high-fat diet were given to rats to make atherosclerotic model, different parts of Mallotus furetianus were administered to prevent the development of atherosclerosis. After 9 weeks, rats were killed and the blood sample was collected to determine the level of MDA and the activities of SOD, NOS. Vascular circles were made to measure endothelium dependent vascular relaxation.  Results  The extract of Mallotus furetianus was capable of removing DDPH free radical, and reducing MDA, enhancing the activities of SOD, NOS, improving the ability of endothelium dependent vascular relaxation.  Conclusion  The extract of Mallotus furetianus can improve the ability of endothelium dependent vascular relaxation in atherosclerosis rats, this effect is possibly associated with the ability of clearance of free radical, increasing activity of NOS, and the enhanced antioxygen capability.

    Key words：Mallotus furetianus; Atherosclerosis; Antioxidation; Free radical

    山苦茶(Mallotus furetianus)是大戟科野桐属植物，产于海南各地，具有清热解毒、利胆消食等功效［1］。山苦茶可以促进胆汁的合成和排泄，有助于胆石的排除，对胆道疾病的患者取得较好的临床效果［2］，动物实验证明，山苦茶组分B、D具有显著的利胆作用［3］。动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是以高脂血症、脂质代谢紊乱，引起脂质过氧化，损伤动脉内皮细胞，形成粥样斑块为特征的疾病。本文研究山苦茶组分B、D对动脉粥样硬化大鼠血管内皮功能的影响及可能的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物 

　　健康雄性Wistar大鼠90只，体重200～300g，由长春高新医学动物实验研究中心提供，合格证号：SCXK-(吉)2003-0004。

　　1.2 药品与试剂 

　　山苦茶叶中两种不同的提取部位B和D，由海南医学院化学教研室提供。二苯代苦味肼基自由基（DPPH）（Fluka公司）；无水乙醇（分析纯，广州试剂厂）；羧甲基纤维素钠（上海黄河制药厂）；胆固醇（北京化学试剂公司）；猪胆盐（北京化学试剂公司）；它巴唑（上海复星朝晖药业有限公司）；维生素 D3（上海通用药业股份有限公司）；维生素 E（上海金伴药业有限公司）；苯肾上腺素（PHE）（上海禾丰制药有限公司）；乙酰胆碱（ACh）（上海试剂三厂）；过氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、一氧化氮合酶（NOS）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒由南京建成生物工程研究所第一分所提供。

　　1.3 仪器 

　　721分光光度计（上海第三仪器分析仪器厂）；LXJ-Ⅱ型高速离心机（上海医用分析仪器厂）；HANGPING FA1104电子分析天平：上海天平仪器厂；电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厂；BL-420生物机能实验系统、HW-400S恒温平滑肌浴槽：成都泰盟科技有限公司。

　　1.4 方法

　　1.4.1 山苦茶不同组分清除自由基测试［4,5］ 

　　将DPPH以无水乙醇为溶剂配制为6×10-4mol/L的储液，放置于4℃冰箱，临用前用同一溶剂将其稀释为6×10-5mol/L待用。将山苦茶B、D及维生素C以无水乙醇为溶剂分别配成150、25和0.04g/L，然后将B、D梯度稀释为0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.005和0.001g/L，将维生素C梯度稀释为0.04、0.02、0.01和0.005g/L，取上述各组分0.5ml，与2.5ml DDPH反应，反应总体积3.0ml，于1cm比色杯中，517nm处测吸光度，每一吸光度平行测3次，取平均值，计算自由基清除率及自由基清除率为50％时各组分的浓度，即EC50。表1  DDPH加样表（略）
   
　　清除率％＝（1-Ai-AjA0）×100％

　　1.4.2 山苦茶不同组分对动脉粥样硬化大鼠抗氧化能力及血管内皮功能的影响

　　将大鼠随机分为正常对照组、模型组、维生素E(0.20g/kg)、山苦茶B高剂量组0.081g/kg、山苦茶B低剂量组0.026g/kg和山苦茶D 0.057g/kg。各药物均以0.5％羧甲基纤维素钠为溶剂配制。除正常对照组外，其余各组给予高脂饲料饲养，同时灌胃给予相应的药物，给药容积为10ml/kg体重；正常对照组和模型组给予相应体积的0.5％羧甲基纤维素钠。取Wistar大鼠90只，适应性喂养1周后，随机抽取15只作为正常对照组，普通饲料(长春高新医学动物实验研究中心提供)喂养，饮自来水；其余各组大鼠一次性腹腔注射VD370万U/kg，高脂饲料(2%胆固醇＋0.5%猪胆盐＋0.2%它巴唑＋5%白糖＋10%猪油＋82.3%普通饲料)饲养9周（在杨彭远等［6］基础上有所改变），饮用自来水。

　　1.4.3 抗氧化能力测定 

　　给药9周末，各组大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，经颈总动脉插管取血。1 000rpm离心15min，取上清。黄嘌呤氧化法测定SOD活性；硫酸巴比妥比色法测定MDA；化学比色法测NOS；具体操作按南京建成试剂盒要求进行。

　　1.4.4 内皮依赖性血管舒张实验［7］ 

　　大鼠采血后，迅速取出胸主动脉，制成宽3mm的胸主动脉环，保留血管内膜，置于通0.95 O2+0.05 CO2混合气体、pH7.4 的正常Krebs 液的浴槽中。此液配制为(mmol/L)：NaCl 115.0；KCl 4.6；MgSO4 1.16；NaH2PO4 1.16；NaHCO3 21.9；CaCl2 2.5；葡萄糖11.0。标本负荷2.0g，平衡2h，每20min 换营养液1次。在采集资料前,主动脉环用60mmol/L KCl 液每隔20min 收缩一次,直至标本收缩反应可重现。用1μmol/L PHE收缩标本，待收缩达坪值后，按累积浓度法加入ACh，记录ACh 每一累积浓度时血管舒张效应，以PHE 引起收缩的松弛率表示ACh的血管舒张效应。

　　1.4.5 统计学处理 

　　结果以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件包进行单因素方差分析，计量资料采用组间t检验(方差不齐时用t’检验)。

　　2 结果

　　2.1 山苦茶各组分对DPPH自由基清除能力的比较 

　　山苦茶各组分对DPPH自由基清除EC50的比较：山苦茶B >维生素 C >山苦茶D。具体见表2。表2  山苦茶B、D清除DDPH能力与维生素C比较的t值组别EC50（略）

　　2.2 山苦茶各组分对动脉粥样硬化大鼠抗氧化能力的影响 

　　模型组大鼠SOD、NOS较正常组明显降低（P＜0.01）；MDA较正常组明显增加（P＜0.05）；山苦茶B、山苦茶D、维生素 E均能明显增加动脉粥样硬化大鼠的SOD、NOS活性，降低MDA。其中，山苦茶D对SOD、MDA影响最为显著，山苦茶B 低剂量对NOS的影响最为显著，具体见表3。表3  山苦茶各组分对动脉粥样硬化大鼠抗氧化能力的影响(略)注：与模型组比较,P＜0.05,P＜0.01；与正常组比较,△P＜0.05,△△P＜0.01。

　　2.3 山苦茶各组分对动脉粥样硬化大鼠内皮依赖性血管舒张实验的影响 

　　模型组大鼠对ACh引起的内皮依赖性血管松弛作用明显降低，山苦茶B、山苦茶D、维生素E均能改善动脉粥样大鼠ACh引起的内皮依赖性血管松弛作用，其中，以山苦茶D的作用最为显著，具体见表4。表4  山苦茶各组分对Ach引起的内皮依赖性松弛作用(略)

　　3 讨论

    以动脉粥样硬化（AS）为病理基础的心脑血管疾病是当今发病率和病死率最高的疾病，Ross［8］于1999年在其“损伤反应学说”基础上提出，AS是一种炎症反应性疾病，其病理表现为变质、渗出、增生。高血压、高血糖、高脂血症、脂质过氧化都是AS炎症的诱发因素。近年来，氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）与动脉粥样硬化的关系越来越受到人们的关注。高脂血症引起脂质代谢紊乱，LDL增多，LDL的氧化产物OX-LDL增多。OX-LDL损伤动脉内皮细胞，使内皮细胞对LDL的通透性增加，胞浆发生空泡变性,浆膜皱缩,甚至可使细胞最终坏死。自由基清除实验表明，山苦茶组分B、D均有清除自由基的作用，其清除自由基能力：山苦茶D>维生素C>山苦茶B。山苦茶组分B、D能明显降低动脉粥样硬化大鼠的脂质过氧化产物，提高抗氧化能力，山苦茶B在低剂量即能发挥抗氧化作用，其抗氧化能力并不随剂量的增加而提高。山苦茶D抗氧化能力强于山苦茶B，这与自由基清除实验结果一致。山苦茶B、D均能增加NOS活性，增加NO的生成，改善动脉粥样硬化大鼠的血管内皮功能。山苦茶组分B、D通过清除自由基，降低脂质过氧化产物，提高动脉粥样硬化大鼠的抗氧化能力，降低动脉内皮细胞的脂质过氧化损伤，减轻AS的炎症反应，改善血管的舒张能力。同时，山苦茶B、D通过增加动脉粥样硬化大鼠的NOS活性，增加血管内皮细胞NO的生成，改善ACh引起的内皮依赖性血管舒张作用。

    总之，山苦茶提取物B、D均能够改善动脉粥样硬化大鼠的内皮依赖型血管舒张，这可能与其增强NOS的活性、清除自由基、提高动脉粥样硬化大鼠的抗氧化能力有关。

【参考文献】
  　　［1］林海,周升. 海南山苦茶的生物学特性及其生态分布［J］. 海南大学学报自然科学版，1992，10(4):32～34.

　　［2］冯朝义，欧安树，吴雷震，等. 海南山苦茶治疗胆道疾病56 例临床观察［J］.海南大学学报自然科学版,1995,13(1):74～76.

　　［3］王九辉，李佩琼，林莲波，等.山苦茶利胆部位活性筛选［J］.中国热带医学，2006，6（1）23～24.

　　［4］许申鸿，杭瑚.一种筛选自由基清除剂的简便方法［J］.中草药，2000，31（2）96～97.

　　［5］池明宇，张澄波，郑贵元，等.分光光度法测定中药的自由基清除剂［J］.中国医药学报，2003，18（9）567～568.

　　［6］杨彭远，芮耀诚，焦亚斌.动脉粥样硬化大鼠实验模型的建立［J］.第二军医大学学报，2003，24（7）802～804.

　　［7］Shen JZ, Zheng XF. Characteristics of impaired endothelium dependent relaxation of rat aorta after streptozotocin－induced diabetes［J］. Acta Pharmacol Sin, 1999, 20(9):844～850.

　　［8］Ross R. Atherosclerosis an inflammatory disease［J］. New Engl J Med, 1999,340(2):115.