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【摘要】 目的 探讨用实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数时，不同抗凝剂对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。方法 采集40例乙型肝炎患者血液，分别置于不含抗凝剂及含肝素钠、枸缘酸钠、EDTA-K2抗凝剂的无菌试管中，分离血清和血浆后于-20℃冰箱保存备用。采用实时荧光定量PCR方法检测血清和血浆中乙型肝炎病毒DNA的拷贝数，用配对t检验对检测结果进行统计处理。结果 40例乙型肝炎患者不含抗凝剂组的乙型肝炎病毒DNA拷贝数的对数均数为5.66±2.10，含肝素钠组的对数均数为5.42±2.26，含枸缘酸钠组的对数均数为5.36±2.11，含EDTA-K2组的对数均数为5.58±2.16。三种含抗凝剂的标本分别与不含抗凝剂的血清组标本中的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换为对数经配对t检验统计处理，含肝素钠组和枸缘酸钠组的DNA拷贝数与不含抗凝剂组DNA拷贝数差异有统计学意义（P<0.05），而含EDTA-K2组的DNA拷贝数与不含抗凝剂组的的DNA拷贝数差异无统计学意义（P>0.05）。结论 实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数，应避免使用含肝素钠和枸缘酸钠的血浆标本，使用不含抗凝剂或含EDTA-K2抗凝剂的无菌试管收集标本。
【关键词】 乙型肝炎病毒；DNA定量；抗凝剂；PCR
Effect of anticoagulants on quantitative detection of HBV DNA.
PAN Chun-yan, MO Bao-mei, LIU Qian-ru, et al.
Baoan District People’s Hospital , Shenzhen 518101,Guangdong, P.R. China
Abstract：Objective To explore the effect of different anticoagulants on quantitative assays for HBV DNA using real-time PCR technique. Methods Peripheral blood samples were obtained from 40 patients infected with HBV. Serum and plasma samples from three kinds of anticoagulants such as heparin, trisodium citrate, and dipotassium EDTA were stored at -20℃. Copies of HBV DNA were determined using real-time PCR technique. Paired t- test was used for statistical analysis. Results The logarithmic model to describe the copies of HBV DNA. The logarithmic mean value for copies/mL of HBV DNA in serum was 5.66±2.10, and the value for plasma samples from three kinds of anticoagulants such as heparin, trisodium citrate, and dipotassium EDTA were 5.42±2.26, 5.36±2.11, 5.58±2.16, respectively. Copies of HBV DNA in plasma samples from anticoagulants heparin and trisodium citrate had a significant difference compared with that in control serum samples in this study (P<0.05). The difference was not significant between plasma samples from anticoagulant dipotassium EDTA and the control serum samples (P>0.05). Conclusion Serum samples should be collected instead of plasma samples from anticoagulants heparin and trisodium citrate when copies of HBV DNA were detected. Plasma samples from anticoagulant dipotassium EDTA is also used with quantitative assays for HBV DNA.
Key words：HBV；DNA quantity；Anticoagulants；PCR
血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判断乙型肝炎病毒在体内是否复制，患者传染性高低及选择治疗方案的重要指标。目前临床一般采用实时荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒DNA拷贝数进行定量检测。实时荧光定量PCR技术融汇了PCR技术的高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性等优点，通过直接检测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。但此技术可能与标本状态密切相关，如溶血、脂血、标本采集等。有研究表明肝素可抑制Taq DNA聚合酶的活性，干扰HBV DNA的合成，导致DNA定量测定结果偏低［1］。抗凝剂枸缘酸钠和EDTA-K2对HBV DNA定量检测结果是否有影响，较少有文献报道。本文通过使用三种不同抗凝剂收集标本，来探讨抗凝剂对定量检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数的影响。
1 对象与方法
1．1 对象
我们收集了HBsAg、HBeAg或HBeAb、HBcAb阳性，HBV DNA拷贝数大于500copies/ml的乙型肝炎患者40例，其中男性23例，女性17例，年龄在17～59岁之间。
1.2 试剂及材料
深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA定量检测试剂盒（批号：20070801）、乙型肝炎病毒DNA阳性标准品（批号：20070801）。一次性不含抗凝剂及含肝素钠、枸缘酸钠、EDTA-K2抗凝剂的无菌试管由深圳市保安医疗用品有限公司提供（批号：071101）。
1.3 仪器
Lightcycle荧光PCR扩增仪(罗氏公司)、高速低温离心机（Sigma公司）、干式恒温器（ 杭州蓝焰科技有限公司）、低温冰箱（SANYO公司）。
1.4 方法
1.4．1 标本的收集
抽取40例乙型肝炎患者血液，每位患者的血液分别定量加入到不含抗凝剂及含肝素钠、枸缘酸钠、EDTA-K2三种抗凝剂的无菌试管中，1h内分离血清和血浆，置于-20℃冰箱保存备用，在3d内进行检测。以上使用的无菌试管所含抗凝剂均为粉剂，因此不会对血液起稀释作用。
1.4．2 乙型肝炎病毒DNA模板制备
取待测样本及阴、阳性对照品（试剂盒备有）各100μl,分别加入到0.5ml的离心管中，再分别加入100μl DNA提取液1，震荡混匀，13 000rpm离心10min；吸弃上清液，再加入25μl提取液2，震荡至沉淀完全散开，100℃干浴10min；冷至室温后,13 000rpm离心10min,保留上清液备用。
1.4.3 PCR扩增
从试剂盒中取出乙型肝炎病毒DNA扩增反应液、Taq酶及UNG，室温融化后按规定比例混合均匀，根据试剂盒说明书配制反应液，分装于Roche毛细扩增管中，每次实验均设2管阴性对照，1管强阳性对照，1管临界值阳性对照， 4管乙型肝炎病毒阳性标准品，其拷贝数分别为5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107 copies/ml，将上述对照及标本各加2μl于加好反应液的Roche毛细管中，短暂离心后上机扩增。对检测结果高于5.0×107copies/ml的标本进行稀释后再扩增，使其结果落在试剂盒检测线性范围内。
1.4.4 核酸扩增与荧光数据采集
扩增条件设置为37℃孵育3min； 94℃变性1min；再进入40个循环，每一个循环包括92℃变性5s，60℃退火及延伸30s,在60℃时单点收集荧光信号；仪器检测通道选择F1通道。
1.4.5 分析条件设定
选择F1通道，点击Quantification进入定量分析窗口，设定Analysis方式为proportional,选定Noise bank项，阈值选定为刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数据为准。
1.4.6 数据分析
四个阳性标准品Ct值均须小于38.0，标准曲线的拟合度须小于-0.980，阴阳对照品扩增须符合预期要求，得出的待测样品的拷贝数才为可信结果。
1.4.7 统计学处理
将测得的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换成常用对数，再利用SPSS软件包进行统计，将3种含抗凝剂的血浆组的HBV DNA拷贝数分别与不含抗凝剂的血清组的HBV DNA拷贝数组间差异采用配对t检验进行差异性检验。
2 结果
40例乙型肝炎患者血清及分别使用3种不同抗凝剂收集的血浆中乙型肝炎病毒DNA拷贝数分别见表1。表1 血清及使用抗凝剂收集的血浆中乙型肝炎病毒DNA拷贝数及统计（略）
使用肝素钠、枸缘酸钠、EDTA-K2收集的血浆组所含HBV DNA拷贝数分别与血清中HBV DNA拷贝数进行配对t检验，统计结果显示含肝素钠组和含枸缘酸钠组的P值均<0.05，结果差异有统计学意义，而含EDTA-K2血浆组P>0.05，无统计学意义。
3 讨论
实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数已在临床广泛使用，但在临床测定中，影响拷贝数的因素也较多，如实验室条件，操作人员的技术水平，临床标本的收集及保存等。有研究认为肝素可抑制Taq DNA聚合酶活性，因此使用肝素钠抗凝剂收集标本可使HBV DNA拷贝数的测定结果降低，但对枸缘酸钠或EDTA-K2作为抗凝剂是否会影响HBV DNA拷贝数较少有文献报道。
本文通过抽取40例乙型肝炎患者的血液分别定量加入到不含抗凝剂、及含肝素钠、枸缘酸钠、EDTA-K2的无菌试管中。使用患者自身的血清作为对照，采用实时荧光定量PCR技术分析使用3种不同抗凝剂收集的血浆标本中乙型肝炎病毒DNA拷贝数，结果显示使用肝素钠和枸缘酸钠收集的血浆中HBV DNA拷贝数与血清中HBV DNA拷贝数差异有统计学意义（P<0.05），而使用EDTA-K2作抗凝剂收集的血浆中HBV DNA拷贝数差异无统计学意义(P>0.05)。从统计结果分析，使用枸缘酸钠和肝素钠作为抗凝剂收集的血浆中，HBV DNA拷贝数均有降低，其中含枸缘酸钠抗凝剂的血浆中拷贝数降低更为明显。肝素钠降低HBV DNA拷贝数，这一点本研究与以往文献报道一致［1］。其原因可能是肝素抑制了Taq DNA聚合酶活性，降低了HBV DNA的扩增速率，使检测结果偏低。使用枸缘酸钠作抗凝剂收集的血浆标本中，HBV DNA拷贝数较血清低，且存在显著性差异，这与以往报道不同，陶志华等认为使用枸缘酸钠作抗凝剂收集的血浆标本中HBV DNA拷贝数与血清差异无统计学意义，这可能是抗凝剂的使用方法不同［2］。在我们所用方法中，枸缘酸钠抗凝剂为粉剂，因此收集的血浆没有被稀释与血清具有可比性，故我们认为枸缘酸钠会影响聚合酶链反应，但如何影响须进一步研究。使用EDTA-K2作为抗凝剂收集的血浆标本中，HBV DNA拷贝数与血清差异无统计学意义，这一点已被众多研究所证实。需要注意的是，本文仅使用深圳匹基公司试剂盒，不同厂家，是否会因为使用不同的提取液及提取方法而出现不同的结果，有待进一步的观察与研究。有文献报道，不同提取方法对检测结果也有一定的影响［3,4］。在临床检验中，不同的实验需要不同的标本收集和保存方法，必须根据不同的实验和检测性质合理进行选择，才能获得准确检测结果。我们认为在检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数时，应避免使用肝素钠或枸缘酸钠作为抗凝剂收集的血浆标本，尽可能使用无菌干燥管收集血清标本，必要时可使用EDTA-K2作为抗凝剂收集的血浆标本。
【参考文献】
［1］郭华国，桂瑞丰，汪宏，等. 高血脂、肝素对乙型肝炎病毒DNA实时荧光定量PCR测定干扰机制的探讨［J］. 现代检验医学杂志，2007，22（1）：58～60.
［2］陶志华，谢耀盛，周武，等.不同样本对实时荧光定量PCR法测定HBV DNA结果的影响［J］. 临床检验杂志，2001，19（6）：345～346.
［3］程正江，付文荣,曾平凡.荧光定量聚合酶链反应直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及评价［J］. 中华检验医学杂志，2004，27（2）：102～103.
［4］李金明，王露楠. 样本处理对聚核酶链反应测定乙肝病毒核酸的的影响［J］. 中华检验医学杂志，2000，23（6）：337～339.
作者单位：深圳市宝安区人民医院检验科，广东 深圳 518101.