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【摘要】 目的 建立丹七滴丸中丹参、三七的定性和定量方法。 方法 采用TCL法对丹参、三七进行定性鉴别；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZORBAX SB-C18)，以甲醇-1%冰醋酸(10：90)为 流动相，检测波长280nm测定丹参素钠含量；以乙腈-0.1%磷酸(22：78)为流动相，检测波长203nm测定三七皂苷R1含量。 结果 丹参、三七鉴别特征明显、专属性强、阴性无干扰；丹参素钠在0.4008～2.004μg范围内线性关系良好，平均回收率为97.08%；三七皂苷R1在1.0～5.0μg范围内线性关系良好，平均回收率98.58%。 结论 本鉴别和含量测定方法简单、快速、准确，可作为本品定性和定量的检测方法。
【关键词】 丹七滴丸；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法；丹参素钠；三七皂苷R1
丹七滴丸配方来源于中华人民共和国国家药品监督管理局标准 WS3-B-0047-98《 丹七片》，现改剂型为滴丸。本品处方仅含丹参、三七两味，原剂型质量标准仅设立了一项理化鉴别和一项显微鉴别，通过研究，其质量标准在原制型的基础上增加了丹参、三七的TLC鉴别，实现对方中两味药的薄层鉴别和有效成分丹参素及三七皂甙的含量测定，为本品的质量控制提供了较为全面的可控手段。
1 材料与方法
1.1 材料 丹七滴丸 (批号：050801,050802,050803，本所试试制样品)与丹参、三七药材（药店购买）；丹参素钠对照品(110855-200405),三七皂苷R1对照品（110745-200516）, 由中国药品生物制品检定所提供;岛津LC-10AD高效液相色谱仪;流动相所用的试剂为色谱纯,其它试剂、试药均为分析纯。
2 结果
2.1 丹参的TLC鉴别 取本品3g，加甲醇25ml，加热回流提取60min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解，加5滴稀盐酸，以乙醚萃取二次，每次20ml提取液置分液漏斗中，加乙醚萃取三次，每次20ml，合并乙醚液，水浴挥干，残渣用1ml甲醇溶解，作为供试液。另取丹参对照药材3g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2005版附录Ⅵ B）试验。吸取上述试液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（8：7：1.4）作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇液：1%铁氰化钾乙醇液的混合溶液（1：1），105℃烘5min，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.2 三七的TLC鉴别 取本品研细，称取1.5g，加入水饱和的正丁醇溶液30ml，超声处理20min，滤过，滤液以正丁醇饱和的水溶液洗涤二次，每次10ml，取正丁醇溶液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。另取三七药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2005版附录Ⅵ B）试验。吸取上述试液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇：水（15：40：22：10）5℃放置12h的下层液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇液，110℃至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.3 丹参素钠的含量测定
2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZORBAX SB-C18)；流动相：甲醇-1%冰醋酸(10：90)；检测波长：280nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：以丹参素钠峰计算应不低于2500。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取取丹参素钠对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含约含丹参素钠40μg的溶液，即得。
2.3.3 供试品溶液的制备 取本品20丸,精密称定,研细,取约4g,精密称定，置圆底烧瓶中，精密加50%甲醇25ml，精密称定，加热回流1h，冷却，精密称定，加50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 样品的测定 取供试品溶液与对照品溶液注入液相色谱仪,测定,以外标计算，在本色谱条件下丹参素钠对照品的保留时间和样品中丹参素钠的保留时间均约为12min。
2.3.5 测定波长的选择 精密量取丹参素钠对照液置比色皿中在波长200～400nm之间测定吸光度,确定最大吸收波长为280nm。
2.3.6 标准曲线制备 精密吸取浓度为100.2μg/ml丹参素钠对照品溶液4、8、12、16、20μl进样，以峰面积对浓度计算回归方程为A=34781C+69122，相关系数r为0.9996。结果表明在0.4008～2.004μg范围内线性关系良好。
2.3.7 精密度实验 吸取同一供试品溶液，依法分别重复进样6次，测其峰面积，丹参素钠供试品液6次测定的峰面积平均值为1431852,RSD为0.51%；结果表明精密度良好，仪器性能良好。
2.3.8 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，每隔一定时间向高效液相色谱仪注入一针，分别在0、2、4、6、8h进行测定，考察了8h内的稳定性,供试品中丹参素钠的RSD为0.74%,实验结果表明，待测液放置8h基本稳定。
2.3.9 重复性试验 取同一批样品6份,按供试品制备及色谱条件项下,进行提取,制备,测定。同批样品6次测定的结果,丹参素钠的RSD为1.48%,说明方法重现性良好。
2.3.10 回收率试验 取已知含量的同一批样品6份,,每份约2g,加入50%甲醇24ml,对照液0.512mg/ml ,1ml, 加热回流1h，冷却，精密称定，加50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，测定, 计算回收率。丹参素钠的平均回收率为97.08%，RSD为1.20%。
2.3.11 阴性试验 取对照品溶液、供试品溶液与空白溶液(处方中不加丹参的样品),分别采用上述色谱条件,进行测定。样品与对照品在同一保留时间有相同的波峰出现,而空白溶液则无相应的峰,证明空白样品不干扰测定,含量测定专属性强。
2.4 三七皂苷R1的含量测定
2.4.1 色谱条件:色谱柱 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZORBAX SB-C18)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(22：78)；检测波长:203；柱温:室温；流速:1.0ml/min；理论板数:按三七皂苷R1峰计算应不低于5000。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取三七皂苷R1对照品适量，精密称重，加30%甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 100μg的溶液，即得。
2.4.3 供试品溶液的制备 取本品10丸,精密称定,研细,取约1g,精密称定, 置圆底烧瓶中，精密加30%的甲醇25ml,称定重量, 超声提取30min，冷却，精密称定，加30%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液10ml，加0.5%的氢氧化钠溶液10ml，用水饱和的正丁醇萃取4次（20、20、15、10ml），合并正丁醇萃取液，加水5ml洗涤，弃去水洗液，正丁醇层蒸干，残留物用30%甲醇少量多次，定量转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，虑过，作为供试品溶液。
2.4.4 测定波长的选择 精密量取三七皂苷R1对照液置比色皿中在波长190～400nm之间测定吸光度,确定最大吸收波长为203nm。以此测定波长测定三七皂苷R1的含量。该测定波长与文献报道值一样。
2.4.5 标准曲线制备 精密吸取浓度为250μg/ml三七皂苷对照品溶液4、8、12、16、20μl进样，以峰面积对浓度计算回归方程为A=13672C+71689，相关系数r为0.9998。表明在1.0～5.0μg范围内线性关系良好。
2.4.6 精密度实验 吸取同一供试品溶液，依法分别重复进样6次，测其峰面积，三七皂苷R1供试品液6次测定的峰面积平均值为1446569,RSD为0.83%；结果表明精密度良好，仪器性能良好。
2.4.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，每隔一定时间向高效液相色谱仪注入一针，分别在0、2、4、6、8h进行测定，考察了8h内的稳定性,供试品中三七皂苷R1的RSD为1.35%,实验结果表明，待测液放置8h基本稳定。
2.4.8 重复性试验 取同一批样品6份,按供试品制备及色谱条件项下,进行提取,制备,测定。同批样品6次测定的结果, 三七皂苷R1的RSD为1.58%,说明方法重现性良好。
2.4.9 回收率试验 取已知含量的同一批样品6份,每份约0.5g,加入30%甲醇24ml,对照液0.512mg/ml,1ml, 加热回流1h，冷却，精密称定，加30%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液10ml，加0.5%的氢氧化钠溶液10ml，用水饱和的正丁醇萃取4次（20、20、15、10ml），合并正丁醇萃取液，加水5ml洗涤，弃去水洗液，正丁醇层蒸干，残留物用30%甲醇少量多次，定量转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，虑过，进样、测定峰面积, 计算回收率。三七皂苷R1的平均回收率为99.58%,RSD为1.42%。
2.4.10 阴性试验 取对照品溶液、供试品溶液与空白溶液(处方中不加三七的样品),分别采用上述色谱条件,进行测定。样品与对照品在同一保留时间有相同的波峰出现,而空白溶液则无相应的峰,证明空白样品不干扰测定,含量测定专属性强。
3 讨论
3.1 提取溶剂的选择 在丹参素钠的测定过程中,只需用50%的甲醇超声提取,滤液直接进样即可,简便、快捷、波峰分离良好。曾采用乙醚、氯仿或正己烷萃提除杂,萃取液蒸干,再用甲醇溶解,进样。结果表明:丹参素钠和原儿茶醛酸化游离后,在非极性有机溶剂中,溶解度较小,无法提取至尽,难以定量测定。
在三七皂苷R1的含量测定研究过程中，曾对比了甲醇、50%甲醇和30%甲醇的提取效果，结果表明:甲醇不但比含水甲醇提取的含量低,而且提取的脂溶性杂质多,容易污染柱。通过采用30%的甲醇为提取溶剂,超声提取, 用碱性水溶解,正丁醇萃取，可最大限度除去强保留的脂溶性杂质。
3.2 提取方法的选择 在两种成分的含量测定研究过程中,曾分别比较了超声提取和回流提取效果,结果表明二者无明显差异,从省时、节能等方面考滤，选择超声作为两种成分的提取方法。
3.3 测定成分的选择 本品由丹参、三七两种药材组成，丹参中主要有效成份有丹参酮、丹参素钠等，在研究过程中，丹参素钠在色谱图中能较好地与其他峰分离，特征明显，因此选择丹参素钠作为丹参的定量指标。三七中主要有效成分为人参皂苷、三七皂苷等，由于三七皂苷是区别人参和三七的主要活性成分，因此选择三七皂苷R1作为三七的定量指标。
【参考文献】
1］ 中国药典2005年版一部.
［2］ 常新全.中药活性成分分析手册［M］.第1版.北京:学苑出版社,2002.
作者单位：海南省药物研究所，海南 海口 570216.