高效液相色谱法测定槟榔中对羟基苯甲酸酯类

【摘要】  目的 建立槟榔中对羟基苯甲酸酯类的测定方法。 方法 样品经无水乙醇提取分离后用高效液相色谱法测定。 结果 在线性范围内线性关系r>0.999，RSD<3.0%，加标回收率94.0%～102.5%。 结论 该法简便、快速、灵敏、准确，可用于槟榔中对羟基苯甲酸酯类的测定。

【关键词】  槟榔 对羟基苯甲酸酯类 高效液相色谱法

槟榔虽然是一种食品，但是目前国家的食品分类中没有槟榔，也没有槟榔的国家标准，目前只有湖南制定了《湖南省食用槟榔地方标准》，并于2004年作了修改，新标准规定，槟榔制作只能使用两种防腐剂，即脱氢乙酸和对羟基苯甲酸酯类，禁止使用其他防腐剂。原来槟榔中使用的防腐剂主要是苯甲酸钠和山梨酸钾，但槟榔是一种特殊的碱性食品，在碱性环境下，这两种防腐剂容易失效。对羟基苯甲酸酯类对霉菌、酵母菌和细菌有广泛的抗菌作用，其抗菌作用较苯甲酸和山梨酸要强，而且其抗菌效果不像酸性防腐剂那样易受pH值变化的影响，在pH4～8的范围内都有较好的抗菌效果［3］。用于食品防腐剂的对羟基苯甲酸酯类有对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等，其中对羟基苯甲酸丁酯的防腐作用最好，我国主要使用对羟基苯甲酸乙酯、丙酯［3］。在文献［1］中规定食品中对羟基苯甲酸酯类的测定方法为气相色谱法，在文献［2］采用的方法为高效液相色谱法，但所用提取液及流动相均为乙腈，本文用无水乙醇提取槟榔中对羟基苯甲酸酯类后以0.02mol/L乙酸铵+甲醇=50+50作为流动相用高效液相色谱测定，该法准确度和精密度好，检出限低，操作简单，能准确的测定槟榔中对羟基苯甲酸酯类。

　　1  材料及方法

　　1.1  材料  高效液相色谱仪(Waters：486-510型，带紫外检测器)；离心机；超声波清洗器；甲醇：液相色谱纯；0.02mol/L乙酸铵：称取1.54g乙酸铵加水溶解后定容至1 000ml，经0.45μm滤膜过滤；流动相：0.02mol/L乙酸铵+甲醇=50+50；无水乙醇：经液相色谱测定无杂峰。实验用水为超纯去离子水。混合标准储备液：准确称取对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯各0.1000g，用流动相溶解后移入100ml容量瓶，并用流动相定容，即得1.000mg/ml的混合标准储备液。对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯混合标准使用液：用流动相将上述标准储备液稀释成浓度为100μg/ml的混合标准中间液，然后再分别吸取此液10ml、15ml、20ml、25ml、50ml于50ml容量瓶中，用流动相定容，即得20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的混合标准使用液系列。

　　1.2  方法

　　1.2.1  仪器条件  色谱柱:反相C18柱（3.9300mm，5μm），检测波长：254nm，流速：1.0ml/min。

　　1.2.2  样品处理  称取约20g的样品，打碎。准确称取2.5g样品于20ml具塞离心管中，加入5ml无水乙醇，塞严，超声提取2min，于500r/min离心3min，将上清液转至25ml容量瓶中，重复操作2次，合并提取液，用流动相定容至刻度。用0.45μm滤膜过滤，供色谱测定。

　　1.2.3  标准曲线  取上述标准系列10μl进行HPLC分析，保留时间定性，绘制峰面积-浓度标准曲线，见图1。标准溶液谱图见图2。

　　图1  标准曲线及回归方程（略）

　　1.2.5  试样测定  在标准系列分析条件下，吸取处理后的试样溶液10μl进样分析，以保留时间定性,测定其峰面积，根据标准曲线定量计算样品中对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的含量。样品溶液谱图见图3。

　　图2  混合标准溶液分离谱图（略）

　　图3  样品溶液分离谱图（略）

　　2  结果

　　2.1  仪器条件的选择

　　2.1.1  流动相的选择  分别用0.02mol/L乙酸铵+甲醇=30+70；0.02mol/L乙酸铵+甲醇=50+50；0.02mol/L乙酸铵+甲醇=70+30三种不同比例的流动相对混合标准进行测定，发现0.02mol/L乙酸铵+甲醇=50+50的流动相对四种物质的分离效果好且峰形好、出峰时间短，所以选择0.02mol/L乙酸铵+甲醇=50+50作为流动相。

　　2.1.2  流动相流速的选择  流动相的流速对分离物的保留时间、分离度和灵敏度都有一定的影响。经实验，随着流动相流速的增加0.6～1.2ml/min，保留时间逐渐缩短，系统压力逐渐增加，峰高及峰面积逐渐降低。因此在灵敏度满足实验要求的情况下，既要使保留时间尽量提前，又要考虑使系统压力不要过大，本实验选择1.0ml/min作为流动相最佳流速。

　　2.1.3  波长的选择  通过实验发现，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯在检测波长为210、220、254、280和320nm条件下均有吸收，但在254nm处其吸收值大且无杂峰干扰，故选择254nm作为检测波长。

　　2.2  方法的线性范围及检出限  在上述仪器条件及标准曲线下，经多次试验测得其线性范围及检出限分别为：对羟基苯甲酸甲酯(5～150)μg/ml，0.5μg/ml； 对羟基苯甲酸乙酯(10～200)μg/ml，1.0μg/ml；对羟基苯甲酸丙酯(10～200)μg/ml，1.0μg/ml；对羟基苯甲酸丁酯(10～200)μg/ml，1.0μg/ml。

　　2.3  方法的精密度和准确度  取3个不同的样品做加标回收试验，结果见表1。从表1可以看出，变异系数为1.00%～2.69%，说明精密度能满足要求，回收率为94.0%～102.5%，说明有较好的准确度。

　　表1  方法的精密度和准确度试验（略）

　　2.4  干扰试验  若样品中含有一些甜味剂和酸性防腐剂，如：糖精钠、阿斯巴甜、苯甲酸钠、山梨酸钾等，通过试验发现，在以0.02mol/L乙酸铵+甲醇=50+50为流动相的条件下，这些物质的色谱峰均在对羟基苯甲酸甲酯之前流出，不会干扰测定。

　　3  结论
   
　　高效液相色谱法测定槟榔中对羟基苯甲酸酯类，方法准确度和精密度好，检出限低，操作简单，结果可靠，同时，该方法采用无水乙醇为提取液、0.02mol/L乙酸铵+甲醇=50+50为流动相，代替了文献［2］采用乙腈作为提取液和流动相，保护了环境，同时也避免了操作过程中乙腈对实验者造成的身体上的伤害。

【参考文献】
  　　［1］ 中华人民共和国国家标准.食品卫生检验方法理化部分［M］.北京:中国标准出版社,2004.

　　［2］ 食品添加剂分析检验手册［M］.北京:中国轻工业出版社,1999.

　　［3］ 食品添加剂手册［M］.北京:中国轻工业出版社,1999.

　　［4］ 刘奋，戴京晶.高效液相色谱法测定化妆品中防腐剂［J］.实用预防医学，2006，13（5）：1121～1123.

作者单位：长沙市疾病预防控制中心，湖南 长沙 410001