血管内皮抑素对Lewis肺癌细胞的影响

【摘要】  目的 评估血管内皮抑素对lewis肺癌的抗肿瘤作用。 方法 将lewis肺癌细胞系和荷lewis肺癌细胞的C57鼠分别进行不同剂量血管内皮抑素的药敏试验。 结果 血管内皮抑素可以诱导细胞凋亡，凋亡程度与内皮抑素剂量呈正相关。内皮抑素对鼠lewis肺癌有明显的抑瘤作用和抗肿瘤肺转移作用，也明显抑制血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表达，作用程度与内皮抑素剂量呈正相关。应用内皮抑素未观察到消化道反应等类似化疗的副作用，也未观察到其它严重不良反应。 结论 血管内皮抑素有抗肿瘤生长作用。

【关键词】  血管内皮抑素 lewis肺癌 凋亡 血管内皮生长因子(VEGF) 微血管密度(MVD)

1971年Follunan首次提出肿瘤依赖血管生成学说，肿瘤细胞通过血管获得生长所需营养，血管为肿瘤转移提供通道［1］。因此，抑制肿瘤新生血管形成，可抑制肿瘤生长和转移［2］。血管内皮抑素(Endostatin)是1997年哈佛大学的O 'Reilly等［3］发现的一种强有力的血管新生抑制因子。本实验通过对lewis肺癌细胞系及荷lewis肺癌细胞的C57鼠的药敏实验研究内皮抑素对lewis肺癌产生的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料  lewis肺癌细胞系(LLC)  购自上海中科院细胞库；C57小鼠购自北京维通利华公司。

　　1.2  实验药物  血管内皮抑素广东星湖科技公司惠赠；顺铂购自南京制药厂；注射用水购自天津药业集团。

　　1.3  试剂  DMEM培养基购自天津圣东科技发展公司; MTT购自天津圣东科技发展公司; 胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所; 二甲基亚砜购自天津市化学试剂一厂; 胰酶购自Sigm公司; 试剂盒Annexin V-FITC购自晶美生物工程有限公司; SP9003购自北京中山金桥生物技术有限公司；PV6002购自天津市灏洋生物制品科技有限公司；P170购自美国贝克曼库尔特公司；Anti VEGF(C-1) Antibody，PECAM-1购自天津市灏洋生物制品科技有限公司。

　　1.4  器材  流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；普通光学显微镜购自OLYMPUS公司；二氧化碳孵育箱购自香港力康发展有限公司；超级净化工作台购自造鑫企业有限公司；湘仪离心机TDSA—WS购自天象人生物工程有限责任公司；细胞培养板、培养瓶为美国进口；振荡器购自TECAN公司；普通冰箱购自西门子公司。

　　1.5  利用流式细胞技术检测细胞凋亡  取生长旺盛的lewis肺癌细胞7瓶，分别加入血管内皮抑素15、12、8μg、血管内皮抑素8μg+顺铂30μg、顺铂30μg、DMSO 100μl、培养基。加药24h后检测细胞凋亡,按照凋亡试剂盒说明书进行操作,重复3次。

　　1.6  60只C57小鼠随机分为6组，每组10只。将lewis肺癌细胞制成单细胞悬液注射于小鼠的左腋下，每只小鼠注射0.1ml。两周后为6组荷瘤鼠分别皮下注射血管内皮抑素400μg/d/只、300μg/d/只、200μg/d/只和血管内皮抑素200μg+顺铂40μg/d/只及第五组顺铂40μg/d/只，第六组为注射用水0.1ml/d/只。6组的给药时间均为10d。

　　1.7  肿瘤生长曲线的绘制  于加药后每周用游标卡尺测肿瘤长径1次，共计3次。每组取平均值绘制肿瘤生长曲线。

　　1.8  免疫组织化学染色(VEGF和MVD)  将肿瘤和肺的标本用10%甲醛固定24h取材，常规脱水后石蜡包埋。所有蜡块连续切片4张，1张作HE染色，另两张作免疫组化，余备用。按免疫组化试剂盒说明书进行操作，分别做VEGF和MVD染色。

　　1.9  结果判定

　　1.9.1  VEGF的检侧  VEGF为细胞浆着色，清晰棕黄色为阳性判断标准。首先在低倍视野下(100倍)扫视整张石蜡切片，每张切片找出5个微血管密集区，然后在高倍视野下(400倍)记数。每张切片共计数5个视野。  判定标准：(-):无阳性染色细胞，(+):阳性细胞数<25%，(++):阳性细胞数26%～50%,(+++):阳性细胞数>50%。

　　1.9.2  MVD计数方法  首先在低倍视野下(100倍)扫视整张石蜡切片，每张切片找出3个微血管密集区，然后在高倍视野下(400倍)记数。每张切片共计数3个视野,每组计数3张切片。 微血管的判断标准：(1)与邻近的微血管、肿瘤细胞及其它结缔组织成份不相连的、标记清晰的内皮细胞及内皮细胞簇均可做为一个可计数的微血管。(2)可能源于同一微血管的内皮细胞，如染色清晰且相互分离，也可做为单独的微血管计数。(3)血管腔及腔内红细胞的存在不是确认微血管的必备条件。(4)对肿瘤区内的硬化区、肿瘤细胞稀疏区及邻近良性组织区域内的血管不进行计数。(5)对管腔直径大于8个红细胞或管壁有平滑肌存在的血管不进行计数。

　　1.10  统计学处理  统计学处理采用SPSS11.5统计软件。

　　2  结果

　　2.1  利用流式细胞技术检测细胞凋亡，重复3次。15μg血管内皮抑素组与12μg血管内皮抑素组凋亡率高于其它各组，差异有统计学意义（P<0.05）。血管内皮抑素可以诱导细胞凋亡，凋亡程度与内皮抑素剂量呈正相关。

　　图1  15μg内皮抑素组凋亡图（略）

　　2.2  肿瘤生长曲线  不同浓度的血管内皮抑素和顺铂联合血管内皮抑素作用于荷瘤C57鼠产生的影响呈现出如图的趋势。各浓度组均呈现明显的时间—效应关系。对照组肿瘤平均直径明显大于各实验组且生长速度快。

　　2.3  抑瘤率  结果为抑瘤率DDP组为最高，与其它各组有差异P<0.05；400μg组和300μg组次之；200μg+DDP组再次；200μg组抑瘤作用最弱。

　　2.4  肿瘤组织VEGF  统计学分析显示对照组与其余各组之间均存在显著差异(P<0.01)。400μg组与顺铂组之间存在统计学差异(P<0.05)。400μg组与合用组之间存在统计学差异(P<0.05)。400μg组与200μg组之间存在统计学差异(P<0.05)。300μg组与200组之间存在统计学差异(P<0.05)。结果显示400μg与300μg组肿瘤组织VEGF量最少，这两组之间不存在差异。200μg+DDP组、200μg组和DDP组VEGF量次之，它们之间不存在差异。对照组肿瘤组织中VEGF量最多与其余各组均有统计学差异。

　　图2  血管内皮抑素对肿瘤生长曲线图（略）

　　图3  血管内皮抑素Lewis细胞VeGF的影响（略）

　　2.5  肿瘤组织微血管密度  结果表明400μg和300μg组肿瘤微血管密度最小，这两组彼此无差异(P>0.05)。200μg加DDP组肿瘤微血管密度次之。200μg组肿瘤微血管密度再次。DDP组肿瘤微血管密度在各实验组中最多。对照组肿瘤微血管密度最大与其它各组均有差异(P<0.05)。

　　图4  血管内皮抑素对组织血管密度的影响（略）

　　3  讨论
   
　　恶性肿瘤具有无限制浸润性生长和远处转移两大特征，而血管生成是肿瘤浸润生长与转移的一个重要前提。因此，抑制血管的生成对肿瘤的治疗有深远的意义和广阔的前景。传统的抗肿瘤药物由于靶向性差，较易产生毒副作用，而血管抑制疗法为目前的肿瘤治疗提供了一个新途径。随着科学工作者三十余年的不懈努力，目前已发现了多种血管生长抑制因子［1～3］，其中内皮抑素抑制血管新生和抗肿瘤作用最为明显［4］。
   
　　内皮抑素是O'Reilly等从鼠内皮细胞瘤(EOMA)培养液中首次分离出内源性的血管生成抑制剂，经研究发现与血管抑制素(Angiostatin)不同，经克隆鼠内皮抑素基因重组的内皮抑素分子量为20KD，结构由184个氨基酸残基构成，其中酸性氨基酸16个，碱性氨基酸29个，疏水氨基酸占42%，含4个半耽氨酸［3］。Sasaki等报道胶原蛋白XVIII的NCI结构域由N端联合区〔约50个氨基酸残基〕、中央蛋白酶敏感胶链区(约70个氨基酸残基)及C端稳定的内皮抑素结构域(约180个氨基酸残基)构成，胶原蛋白W in可能通过蛋白水解酶而裂解出内皮抑素［5］。内皮抑素作为血管抑制因子家族的一员，靶向血管内皮细胞，通过抑制内皮细胞增生和迁移，拮抗肿瘤的新生血管生成，从而阻断肿瘤的血液供应，使“饥饿”的肿瘤生长受到抑制，进入“休眠状态”并诱导凋亡［6］，在体外、体内试验中，均显示出强大的特异性抑制血管内皮细胞增殖的作用，进而抑制新生血管形成，从而抑制肿瘤的生长与转移［7,8］。
   
　　Ding等用内皮抑素治疗乳腺癌，结果发现肿瘤明显缩小，肿瘤细胞的凋亡指数增加，提示负性的血管调节因子可能通过抑制血管生成而发挥抗癌作用。最近有研究［9］发现，内皮抑素除了抗血管生长活性外，在某些肿瘤细胞系中如结肠癌等，还可能直接发挥抗肿瘤作用。
   
　　内皮抑素是内源胶原蛋白XIII的C末端的非胶原区(NCI)，一般不引起免疫反应。其特异性地靶向增生的内皮细胞，因此，一般不会诱发免疫抑制、骨髓抑制和胃肠道反应。多项研究都已表明了内皮抑素无毒性反应［10］。但是，内皮抑素产生抗肿瘤作用的前提是，必须长期持续维持一个较高的血清或瘤内浓度，因此，理论上可能会对正常的生理过程产生影响，例如影响子宫内膜成熟、黄体形成、胚胎发育以及引起下肢或心脏的慢性缺血性反应、伤口延迟愈合、抑制头发生长。但是，目前尚无临床资料证实。本实验发现皮下注射内皮抑素时鼠挣扎较对照组剧烈，推测大约是皮下刺激明显，但并未发现注射针孔处有愈合不良的表现。注射处皮肤有时有红斑但能在24h内消退。本试验虽未能对是否存在慢性缺血性副反应进行监测，但确实未观察到明显胃肠道反应等其它副作用。
   
　　虽然内皮抑素有很强的抗肿瘤生长作用，但是内源性血管抑制剂只能特异性抑制内皮细胞的新生和移行，不是杀死肿瘤细胞，而是使肿瘤细胞处于“休眠状态”。当内皮抑素在体内消失或体内的促血管生成因子占优势时，肿瘤可再增长。因此肿瘤的治疗应把肿瘤分为两个不同的、可以互为刺激对方生长的细胞群体［11］，一群为肿瘤细胞，另一群为血管内皮细胞。针对内皮细胞的抗血管生成治疗与传统的细胞毒治疗相结合［11～13］，具有药物剂量要求低、副作用小的优势。本试验联合化疗组的疗效并没有优于单药组，与相关报道不符。原因可能是联合治疗组中内皮抑素量较小没有发挥更大作用或者是顺铂并不是非常适合的联用药物。另外用药后观察时间短也是一个原因。关于联合治疗的问题应进一步细致分组，进一步行细化联合治疗的剂量，进一步选择更加适合的药物，进一步延长观察时间来探讨。
   
　　血管内皮细胞生长因子(VEGF)，也称血管渗透因子(VPF)，是目前发现的最重要的血管生长因子，被认为是血管生成的先决条件。目前认为肿瘤的增殖和转移依赖于血管新生［14］，血管新生受很多生化和基因机制的调节［15］。血管生成受到正负两方面因子的调控:血管生成刺激因子和血管生成抑制因子。合理使用内皮抑素可有效地抑制血管的生成，并且无耐药性及毒性反应，O’Reilly等将此称为休眠疗法。本实验分别对肿瘤组织VEGF及荷瘤鼠的肺组织VEGF进行测定。利用免疫组化法染色并计数。肿瘤组织VEGF统计学分析显示：内皮抑素可以有效控制肿瘤组织中的血管内皮生长因子，其控制血管内皮生长因子较化疗药有效，且其对血管内皮生长因子的作用随剂量增加而加强。在对荷瘤鼠肺的研究中，我们加入了一组正常鼠的肺作阴性对照。结果表明内皮抑素可以将肿瘤转移灶中的血管内皮生长因子控制在接近正常的水平。
   
　　血管生成是癌组织生长、浸润、转移的前提，否则其直径不会超过2mm［16］。肿瘤的新生血管不仅为其提供生长必需的营养物质、转运代谢产物，而且还为进入循环系统远处转移提供了通道。但肿瘤新生血管结构上分化差、管壁薄，内皮细胞幼稚，基底膜发育不良，分布与构筑上呈无序状态，不具备完整的收缩和微循环功能，不受神经体液调节［17,18］。选择肿瘤新生血管作为治疗的靶点，即抗肿瘤血管生成治疗，已成为当今肿瘤治疗的热门研究领域之一［19,20］。我们的研究结果表明，内皮抑素可以使肿瘤微血管密度减少，其减少程度与内皮抑素剂量呈正相关。肺微血管密度研究结果表明，内皮抑素组肺微血管密度最小。内皮抑素可以使肿瘤转移灶微血管密度减少。
   
　　凋亡(Apoptosis)这一概念是由Kerr［21］在1972提出的，表示一种细胞主动死亡。肿瘤的生长被认为是正常凋亡机制失活的结果，因此通过化疗药物、射线、热疗和基因疗法诱导加速肿瘤细胞凋亡也是癌症治疗的研究热点。目前许多血管生成抑制剂的作用机制都与促进血管内皮细胞凋亡，抑制增殖有关。内皮抑素在诱导细胞调亡中起重要作用。本实验研究内皮抑素对lewis肺癌细胞凋亡的影响。光学显微镜下观察到经内皮抑素处理12h的内皮细胞出现细胞变圆，体积缩小，胞浆密度加深的凋亡征象。实验结果显示内皮抑素可以诱导肿瘤细胞凋亡，其诱导调亡程度与内皮抑素剂量呈正比。

【参考文献】
  　　［1］ Folkman J. Antiangiogenic gene therapy［J］. Proc. Natl. Acad. Sci.U SA.1999,95(16):9064～9066.

　　［2］ Kong HL, Crystal RG. Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis［J］.J. Natl Cancer Inst, 1999,90(4):273～296.

　　［3］ CaoY Endogenous angiogenesis inhibitors: angiostatin, endostatin, and other proteolytic fragments［J］. Prog Mol Subcell. Biol, 1999,20:161～176.

　　［4］ O'Reilly M S，Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］. Cell,1997,99(2):277～295.

　　［5］ Boehm T, Folkman J, Browder T, et al. Antiangiogenic therapy of experimental cancerdoes not induce acquired drug resistance［J］. Nature, 1997,390(6659)404～407.

　　［6］ Perletiq Concari P, Giardini, et al. Antitumor activity of endostatin against carcinogen-induced rat primary mammary tumors［J］. Cancer Res, 2000, 60(7):1793～1796.

　　［7］ Luo X,Slater JM,Gridley DS.Enhancement of radiation effects by PXLG-mEndo in a lung Cacinoma model Int［J］. J Radiat Oncol Biol Phys,2005,63(2):

　　［8］ Bloch W, Huggel K, Sasaki I, et al. The angiogenesis inhibitor endostatin impairs blood vessel maturation during wound healing［J］. FASEB J, 2000, 14(15):2373～2376.

　　［9］ Kim ES, Herbst RS. Angiogenesis inhibitors in lung Cancer［J］. Curr Oncol Rep,2002,4(4):325～333.

　　［10］ Abraham D, Abri S, Hofmann M, et al. Low dose carboplatin combined with angiostatic agents prevents metastasis in human testicular germ cell tumor xenografts［J］. J Urol, 2003,170(4 Pt 1):1399～1393.

　　［11］ Kerbel RS. A cancer therapy resistant to resistance［J］. Nature, 1997,390(6659): 335～336.

　　［12］ Follkman J. What is the evidence that tumors are angiogensis dependent［editorial］［J］. J Natl Cancer Inst,1990,92(1):4～6.

　　［13］ 陈惠英，王为，秦叔逵.三氧化二砷对人肝癌细胞株VEGF表达的影响［J］.临床肿瘤学杂志，2000,5 (4):封2.

　　［14］ Schuch G, Kisker O, Atala A,et al. Pancreatic tumor growth is regulated by the balance between positive and negative modulators of angiogenesis［J］. Angiogenesis,2002,5(3):181～190.

　　［15］ Robak E, Wozniacka A, Sysa-Jedrzejowska A,et al. Circulating angiogenesis inhibitor eodostatin and positive endothelial growth regulators in patients with systemic lupus erythematosus［J］. Lupus, 2002,11(6):348～355.

　　［16］ Hansma AH, van Hensbergen Y, Kuenen BC, et al. A patient with a VEGF and endostatin producing gastrointestinal autonomic nerve tumour［J］. J Clin Pathol, 2004,57(5):536～538.

　　［17］ Zhao J, Yan F, Ju H, et al. Correlation between serum vascular endothelial growth factor and endostatin levels in patients with breast cancer［J］. Cancer Left, 2004,204(1):87～95.

　　［18］ Wang LD, Shi ST, Zhou Q, et al. Changes in P53 and CyclinDl protein levels and cell proliferation in diferent stages of human esophageal and gastric-carcinogenesis［J］. Int J Cancer, 1994,59(4):51.

　　［19］ Song SH, Jong HS, Choi HH, et al. Transcriptional silencing of cyclooxygenase-2 by hyper-methylation of the 5' CPG island in Human gastric carcinoma cells［J］. Cancer Res,2001,61(11):4629～4635.

　　［20］ Lim JW, Kim H, Kim KH. Nuclear factor-kappa B regulates cyclooxygenase-2 expression and cell proliferation in Human gastric cancer cells［J］. Lab Invest, 2001,91(3):349～360.

　　［21］ Kerr JF,Wyllie AH,Curfe AR. Apoptosis:abasic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetices［J］. Br J Cancer, 1972,26:239.

作者单位：天津医科大学肿瘤医院2003级研究生,天津 300060; 秦皇岛市港口医院,河北 秦皇岛 066003