点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨消栓滴丸的质量控制方法。 方法 采用薄层色谱法（TLC）对黄芪、赤芍、当归及川芎进行定性鉴别和采用高效液相色谱法（HPLC）对黄芪甲苷进行含量测定，色谱柱为C18柱（ODS，4.6mm×200，5μm），流动相为乙腈-水-磷酸（32：68：0.05），流速1.0ml/min，检测波长203nm。 结果 薄层斑点清晰，阴性无干扰；黄芪甲苷在1.42～7.10μg范围内有良好的线性关系（r=0.9999），平均回收率为95.6%，RSD为0.94%。 结论 建立的方法简便、灵敏、准确，可作为本品的质量控制方法。
【关键词】 消栓滴丸 黄芪甲苷 HPLC TLC 质量控制
消栓滴丸是由黄芪、赤芍、当归、川芎等七味药组成。采用煎煮提取、药粉直接入药等工艺加工制成。具有补气，活血，通络的功效，用于中风引起的半身不遂、口眼歪斜等症状的治疗。由消栓颗粒改变剂型而成，为了更有效地控制产品的质量，确保临床疗效，本实验对方中黄芪、赤芍、当归、川芎进行了薄层色谱鉴别，并采用高效液相色谱法［1］对方中黄芪甲苷的含量进行测定，方法简便、可行，重现性好、灵敏度高。将其收为质量标准控制方法，以确保产品的质量。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 高效液相色谱仪(日本岛津LC-10AD液相色谱仪)；SPD-10AVD紫外可见检测器，LC-10ATVP泵；德国沙多利斯BP211D电子分析天平（十万分之一）；日本岛津AEG-120G电子分析天平（万分之一）。
1.1.2 试药 黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0781-200210）；芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110736-200425）、阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0773-9910）；乙腈为色谱纯；超纯水（自制）；其余所用试剂均为分析纯。消栓滴丸及阴性对照样品自制。
1.2 方法
1.2.1 黄芪TLC鉴别［2］ 取本品4g，研细，加水40ml，超声处理20min，滤过，滤液用正丁醇提取两次，每次30ml，合并提取液，用氨试液、水30ml各洗涤1次，弃去水层，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
1.2.2 赤芍TLC鉴别［2,3］ 取本品4g，研细，加水40ml，超声处理20min，滤过，滤液用正丁醇提取两次，每次30ml，合并提取液，用水洗涤两次，每次30ml，弃去水层，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
1.2.3 当归及川芎TLC鉴别［2,4］ 取本品4g，研细，加水40ml，超声处理20min，滤过，滤液用醋酸乙酯-甲酸（9.5∶0.5）30ml提取，分取醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
1.2.4 黄芪甲苷含量HPLC测定［5,6］ 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含250μg的溶液，即得对照品溶液。取供试品，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水30ml，超声处理(250W，50kHz)30min，滤过，锥形瓶用水洗涤2次，每次10ml，滤过，合并滤液，用乙醚提取2次，每次30ml，弃去乙醚层，水层用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次25ml，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水25ml洗涤1次，弃去水层，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（1.0cm,长12cm），以水40ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方比例制成不含黄芪的消栓滴丸，然后按供试品溶液制备方法制成阴性空白样品溶液。色谱条件:Purnter C18色谱柱（4.6mm×200,5μm）；流动相乙腈-水-磷酸（32：68：0.05）；流速1ml/min；柱温为室温，检测波长203nm；灵敏度0.001AUFS，每次注入液相色谱仪20μl。
2 结果
2.1 黄芪TLC鉴别 照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取供试品及对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶20∶10)10℃下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热约5min至斑点显色清晰。结果表明供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同的棕褐色斑点，阴性对照无干扰。
2.2 赤芍TLC鉴别 照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取供试品及对照品溶液各8μl，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加热约5min至斑点显色清晰。结果表明供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，阴性对照无干扰。
2.3 当归及川芎TLC鉴别 照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取供试品及对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸 (8∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁-铁氰化钾（1∶1）溶液。结果表明供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同的蓝色斑点，阴性对照无干扰。
2.4 黄芪甲苷含量测定
2.4.1 测试物在HPLC的显示 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液、阴性对照溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，依法测定峰面积，结果表明在对照品吸收峰的位置，阴性对照溶液无干扰吸收峰。见图1。
图1 消栓滴丸HPLC色谱图（略）
2.4.2 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品0.01776g，用甲醇溶解并定容于50ml量瓶中，摇匀，分别精密吸取2、4、6、8、10ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度中，摇匀，分别精密吸取20μl进样，测得的峰面积，以峰面积A对黄芪甲苷浓度C进行回归处理，回归方程为A=1 000 000C-293.9，r=0.9999，结果表明黄芪甲苷在1.42～7.10μg范围内峰面积与浓度呈线性关系。
2.4.3 重复性试验 按测定方法对同一批供试品（批号050101）取5份，同供试品溶液制备方法处理，分别测其含量,结果RSD%=2.3(n=5)，表明重现性良好。
2.4.4 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液20μl，重复进样5次，测定并记录峰面积，结果RSD%=0.76(n=5)，表明精密度良好。
2.4.5 回收率试验 采用加样回收法，取已知含量(批号050101，含量0.146mg/g)的样品,精密称取6份，置100ml锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.405mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液1ml，按上述含量测定方法测定含量，结果平均回收率=97.21%,RST=0.65%,表明本方法回收率良好。
2.4.6 稳定性考察 取已测样品(批号050101，含量0.146mg/g)，依法制成供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12h后依法进行测定，分别测得峰面积值，结果RSD=1.10%，表明本样品至少在12h内较稳定。
2.4.7 样品测定 按上述方法对3批样品进行黄芪甲苷含量测定,结果见表1。
表1 十批样品测定结果（略）
3 讨论
3.1 黄芪的薄层鉴别研究，消栓片中黄芪的TLC鉴别为用正丁醇提取后经上柱洗脱制成供试品，过程较繁琐。经过试验研究表明用正丁醇提取后用氨试液及水洗制成的供试品展开效果较好，阴性无干扰，采用本方法进行供试品处理。赤芍的薄层鉴别研究，以芍药苷为对照品，样品曾采用黄芪药材鉴别中样品的制备方法进行制备，结果不理想，考虑到可能其成分随氨试液流失，改为水提后用正丁醇萃取，再用水洗即可作为供试品，效果较佳。因当归、川芎药材中均含有阿魏酸，故以阿魏酸作为对照品进行两者的TCL鉴别研究。
3.2 黄芪为方中主药,其主要成分黄芪甲苷亦为主要有效成分，本品采用高效液相法对黄芪中黄芪甲苷的含量测定进行了研究，曾对测定提取时间进行了考察，结果表明超声30min即能够达到提取较完全，故选择提取时间为30min；曾对多种流动相进行选择，结果表明流动相乙腈-水-磷酸(32:68:0.05)分离效果较好。同时对其方法的精密度、稳定性、准确度等各方面进行了考察，结果表明含量测定方法较成熟，可作为本品的质量监控手段。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京:化学工业出版社，2000.
［2］ 尤献民，邹桂欣，张慧影.乳康平颗粒中赤芍、当归及黄芪的薄层鉴别［J］. 时珍国药研究，1997,8(4)：333.
［3］ 杨正裕，孙秀华，郑虎占.黄芪赤风颗粒剂的薄层鉴别［J］.北京中医药大学学报，1999,22（5）：76～77.
［4］ 王建，仇雅静，支荣荣.新伤逐瘀定痛合剂的质量标准研究［J］.中国药师，2004,7（7）：516～518.
［5］ 戴军平，刘秀霞，张平兰，等. HPLC法测定黄芪口服液中黄芪甲苷的含量［J］.西北药学杂志，1999,14（4）：149.
［6］ 路玫，韦戈，蒙大平.RP-HPLC法测定玉屏风颗粒中黄芪甲苷的含量［C］.医学文选，2000,19（3）：290～292.
作者单位：海南省药物研究所，海南 海口 570216.