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【摘要】 目的 检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和组织金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)在不明原因不孕、正常早孕蜕膜组织和正常子宫内膜中的表达，探讨其与不明原因不孕关系。方法 应用免疫组化S-P法，检测MMP-9和TIMP-1在30例不明原因不孕症患者的种植窗期子宫内膜、20例早孕蜕膜组织和20例正常子宫内膜中的表达情况。结果 MMP-9和TIMP-1在宫内早孕蜕膜组织表达程度最高，在正常子宫内膜中表达较高，而在不明原因不孕子宫内膜表达水平显著降低，MMP-9和TIMP-1在三组之间比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 MMP-9和TIMP-1在不明原因不孕子宫内膜中呈低水平表达，且无分泌期表达水平的增强，这可能会导致子宫内膜接受性的降低，使着床失败引起不孕。
【关键词】 不孕症；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制物；子宫内膜；蜕膜
The expression of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 protein in cycling endometrium of patients with primary unexplained infertility.
LI Bin, DU Xing-gui, YAO Jun-xia, et al.
Department of Pathology, Yunyang Medical College, Shiyan 442000, Hubei, P. R. China
Abstract：Objective To detect the expression of matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 protein(TIMP-1) in cycling endometrium of patients with unexplained infertility, normal endometrium and normal early pregnant deciduas and explore the relationship between the expression of MMP-9 and TIMP-1 in unexplained infertility and normal pregancy. Methods Immunohistochememstry(S-P technique) and pathologic image semi-quantification were used to detect the expression of MMP-9 and TIMP-1 in endometrium of 30 unexplained infertility patients and 20 normal early pregnant deciduas and 20 normal endometrium. Results The expression of MMP-9 and TIMP-1 in normal early pregnant deciduas was the highest,showing significant difference as compared with other two groups(P<0.05) The expression of MMP-9 and TIMP-1 was also high in normal endometrium as compared with other two groups(P<0.05). But the expression of MMP-9 and TIMP-1 in endometrium of patients with unexplained infertility was significantly reduced as compared with other two groups(P<0.05). Conclusion In unexplained infertility women, the low expression of MMP-9 and TIM P-1 protein in the implantation window phase may cause the failure of implantation and results in the infertility.
Key words：Unexplained infertility；Matrix metalloproteinases； Tissue inhibitor of metalloproteinase；Endometrium
不孕症是妇科常见病之一，据国外统计发病率约为10%～25%，其中不明原因不孕占所有不孕症的17%，其发病机理尚未完全清楚, 目前尚无确切的诊治措施。近年来发现,子宫内膜局部调节失衡,导致子宫内膜容受性下降,可能是不明原因不孕的病因之一，而基质金属蛋白酶及其自身抑制物组织金属蛋白酶抑制物在子宫内膜种植窗期的高表达, 可能对胚胎着床有重要作用［1］。本实验采用免疫组化S-P法检测30例不明原因不孕子宫内膜组织、20例宫内早孕蜕膜组织和20例正常子宫内膜组织在子宫内膜种植窗期基质金属蛋白酶-9（Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)及组织金属蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 protein，TIMP-1)的分布及表达水平，研究其与不明原因不孕及正常妊娠的关系，探讨不明原因不孕的发病机理，为临床诊断和治疗不明原因不孕提供实验理论依据。
1 材料与方法
1．1 研究对象
选择2000年1月～2005年7月期间到郧阳医学院附属人民医院就诊的不孕症患者和具有对照条件的育龄期妇女子宫内膜。将研究对象分为3组：第1组为不明原因不孕组共30例，入选标准为入选标准为育龄期妇女，年龄24～37岁，月经周期规律，双相基础体温，激素水平测定正常，近3个月内未用过任何激素类药物，子宫腔正常, 双输卵管通畅，男方检查正常，排除解剖﹑感染﹑精神等因素确诊为女性不明原因的不孕症，于月经来潮24h内刮出的内膜组织，其中增殖期10例，分泌期子宫内膜20例(经病理检查证实)。第2组为正常子宫内膜组共20例，为正常生育妇女在月经周期各阶段诊断性刮宫术获取的子宫内膜组织，年龄26～38岁，月经规律，术前3 个月未用激素，其中增殖期8例，分泌期子宫内膜12例(经病理检查证实)。第3组为正常早孕蜕膜组织组共20例，选自同期在门诊自愿要求终止妊娠而行人工流产术的健康妇女的早孕蜕膜组织，年龄24～35岁，停经40～50d，术前3 个月未用激素。第1、2组所有标本经病理学检查，在光镜下根据Noyes标准证实为分泌中期子宫内膜。
1.2 实验方法
所有子宫内膜标本行常规石蜡包埋，5μm厚连续切片4张，分别用于HE染色﹑免疫组化染色和阴性对照用，采用免疫组化SP法检测MMP-9和TIMP-1的表达。鼠抗人MMP-9 和T IMP-1单克隆抗体及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。MMP-9和TIMP-1均采用微波修复抗原，操作步骤按说明书进行，用PBS 代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。
1.3 结果观察与判定
MMP-9和TIMP-1免疫组化染色，在高倍镜下观察,以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达，定性分级标准：-级(阴性)：无棕黄色颗粒;+级(弱阳性)：每高倍视野<10%的细胞胞质内出现棕黄色颗粒;++级(中度阳性)：每高倍视野有10%～60%的细胞胞质内出现棕黄色颗粒;+++级(强阳性)：每高倍视野>60%的细胞胞质内出现棕黄色颗粒;++++级(极强阳性)：每高倍视野近100%的细胞胞质内出现棕黄色颗粒并且采用Motic Images Advanced 3.2生物医学图像分析系统，测定每张切片阳性表达的累积光密度值。在40×10的高倍镜视野下，每张切片选择具有代表性的5个阳性视野，选取空白区定标，测定每个视野的光密度，求平均光密度（Average optical density，AOD），AOD 值越大表明染色越强。
1.4 统计学处理
数据资料中计量资料用均数±标准差(x±s)表示，各组样本均数间比较采用SPSS10.0统计分析软件包进行单因素的方差分析，以a=0.05为检验水准，P<0.05为差别有显著性意义。
2 结果
2.1 定性表达
在全部子宫内膜标本中, MMP-9和TIMP-1均呈不同程度的阳性表达, 腺上皮细胞和基质细胞胞浆内均可见棕黄色颗粒, 空白对照无阳性染色，排除了非特异性染色的可能(表1)。在正常子宫内膜增生期，MMP-9的表达水平低，分泌期则明显升高，TIMP-1表达特点和表达强度与MMP-9相似。MMP-9和TIMP-1在正常子宫内膜分泌期的表达水平均比增生期强。表1 各组子宫内膜组织中MMP-9和TIMP-1的定性表达（略）
2.2 半定量表达
病理图像半量分析结果见表2，MMP-9和TIMP-1在宫内早孕蜕膜组织表达程度最高，与其它两组相比有显著性差异(P<0.05)；MMP-9和TIMP-1在正常子宫内膜中表达较高，与其它两组相比有显著性差异(P<0.05)；MMP-9和TIMP-1在不明原因不孕子宫内膜表达水平显著降低，与正常子宫内膜及宫内早孕蜕膜组织相比均有显著性差异(P<0.05)。
3 讨论
胚胎着床（Embryo implantation）是一个复杂的生理发育过程，是妊娠成功建立的关键环节，涉及到胚胎的发育、分化、子宫内膜的同步变化及胚胎在子宫内膜的识别、黏附和植入等一系列环节。胚泡的成功植入取决于胚泡侵入性与子宫内膜容受性之间的同步变化与协调。胚胎着床过程中有激素、细胞因子、生长因子、黏附分子、ECM、MMPs和TIMPs等多种因素参与［2］。表2 各组子宫内膜组织中MMP-9和TIMP-1的平均光密度测定结果(略) 注:☆与增生期比较，P<0.05；★与正常子宫内膜分泌期比较，P<0.05；△与两组分泌期比较，P<0.05。
在胚胎着床的过程中，子宫内膜首先发生快速且复杂的变化—蜕膜化反应，在子宫内膜的蜕膜化过程中，子宫内膜基质重新构建，内膜胶原纤维部分降解，内膜间质的组织液增多，呈暂时性水肿，纤维排列分散而疏松，蜕膜化的子宫内膜能够容纳胚泡着床。胚泡穿透子宫内膜是一个主动性过程，需要蜕膜化子宫内膜ECM的降解，子宫内膜及胚泡的滋养层细胞能分泌一系列蛋白水解酶类，其中包括MMPs和TIMPs，它们能够降解子宫内膜基底膜及ECM的不同成分，使胚泡能够进入子宫内膜，完成着床，这一步被认为是胚胎着床的限速步骤［3］。MMPs是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，是ECM降解过程中最为重要的一组蛋白水解酶，几乎能降解ECM的所有成分，与月经发生、内膜重建、内膜血管形成、排卵、胚胎植入等密切相关［4,5］。TIMPs是MMPs的天然抑制物，在人体多种组织和细胞中均可表达，MMPs与TIMPs的比值稳定才能保证ECM新陈代谢的正常进行［6］，MMPs与TIMPs的平衡是维持机体内环境稳定和ECM完整性的关键因素。子宫内膜结构的稳定及各项生理功能的完成离不开ECM的支撑，稳定的ECM需要其组成成分的合成强度高于降解强度，TIMPs的存在不仅能避免对ECM的过度降解，还可参与ECM的更新与重塑，从而对内膜的修复与生长起辅助作用。在胚胎种植中，MMPs和TIMPs的调控也起着重要的作用，子宫内膜和滋养层细胞产生的MMPs通过降解子宫内膜的ECM，促进滋养层细胞的侵入，而TIMPs则通过抑制MMPs间接抑制滋养细胞的侵入，MMPs和TIMPs的调控使得滋养细胞只能侵入蜕膜层［7］，完成胚胎植入过程。MMP-9的主要降解作用底物是IV型胶原，本实验研究发现MMP-9和TIMP-1在正常增生期子宫内膜呈低表达，而高表达于分泌期的子宫内膜和早孕期的子宫蜕膜中，因此推测：正常增生期子宫内膜的低表达，可能有利于内膜的修复与生长；分泌期子宫内膜MMP-9的表达增加，可加强对蜕膜化的ECM的降解，改善子宫内膜容受性，在胚泡成功植入过程中起到了非常重要的作用。本实验发现不明原因不孕子宫内膜MMP-9的表达明显低于正常子宫内膜分泌期，差异有显著性意义（P＜0.05），推测在不明原因不孕患者，由于子宫内膜局部MMP-9分泌不足，导致ECM降解能力降低，子宫内膜功能成熟落后，内膜容受性下降，影响绒毛滋养层细胞穿透母体子宫内膜而导致着床失败引起不孕，从而进一步证明了MMP-9在调节子宫内膜容受性中的作用。而Jeziorska等［8］则认为，MMP-9可能与胚胎识别有关。本实验发现不明原因不孕子宫内膜TIMP-1的表达明显低于正常子宫内膜分泌期，差异有显著性意义（P＜0.05），与增生期内膜无明显差异（P＞0.05），TIMP-1具有拮抗MMP-9对ECM的降解作用，避免滋养层细胞对子宫内膜的过度侵袭，两者之间形成动态平衡，有利于胚泡植入，又可避免滋养层细胞过度侵袭对组织造成损害，使妊娠得以顺利进行。本实验研究结果显示在正常子宫内膜标本中，MMP-9和TIMP-1有不同程度的阳性表达，表现为腺上皮细胞和基质细胞胞质内可见棕黄色颗粒，上皮表达强于基质。但在月经周期的不同阶段表达有差异，增生期子宫内膜中MMP-9和TIMP-1虽有表达，但表达强度较低，且以上皮细胞表达为主，而至分泌期，二者的表达强度均有明显增高，与增生期比较差异有显著性意义(P<0.05)。与李黎吴瑞瑾［9］等的研究结果相似。本实验结果显示宫内早孕蜕膜组织MMP-9的表达明显高于分泌期内膜的表达(P＜0.05)，提示MMP-9除参与胚胎植入过程外，还可能参与了早期妊娠的维持。另外实验也显示，伴随MMP-9的增加而TIMP-1在宫内早孕蜕膜组织中的表达也增加，并明显高于分泌期子宫内膜的表达。蜕膜既高表达MMP-9有利于胚胎绒毛滋养细胞的侵入，同时也高表达TIMP-1抑制MMP-9的功能，二者始终维持一个动态平衡，限制胚胎绒毛侵入的深度，避免滋养层细胞的过度侵袭或ECM的过度降解而导致母体组织损伤或病理性流产发生，使妊娠得以维持。总之，MMP-9和TIMP-1在正常子宫内膜分泌期和宫内早孕蜕膜组织的高表达，主要是为胚泡着床作好准备及胚胎种植成功后正常妊娠的维持。
【参考文献】
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［8］吴瑞瑾，周馥贞．原因不明性不孕患者子宫内膜基质金属蛋白酶-9mRNA的表达及其性激素调节［J］．中华妇产科杂志，2003，38：346～349.
［9］Jeziorska M, Nagase H, Salamonsen L A, et al． Immunolocazation of the matrix metalloproteinases gelatinase B and stromelysin 1 in human endometrium throughout the menstrual cycle［J］. J Rep rod Fertil,1996, 107(1):43～51.
作者单位：1.郧阳医学院病理学教研室，湖北 十堰 442000; 2.郧阳医学院附属太和医院病理科,湖北 十堰 442000; 3.武汉大学医学院病理学教研室,湖北 武汉 430033.