顶空毛细管气相色谱法测定胸腺五肽中乙醚残留量

【摘要】  　　目的 建立顶空毛细管气相色谱法测定胸腺五肽中乙醚残留量的方法。 方法　 以乙醇为内标,采用HP-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)石英毛细管柱测定胸腺五肽中乙醚的残留量。 结果 乙醚在0.0178～0.1426 mg/mL之间呈良好线性关系,r=0.9994;加标回收率为95.77%；RSD 为0.9%。最低检出浓度为0.82μg/mL(S/N=3)。 结论 本方法快捷,灵敏度高,可用于胸腺五肽残留乙醚的检测。

【关键词】  胸腺五肽；乙醚；残留量；气相色谱法

　　胸腺五肽(TP5)是人工合成的五肽，其氨基酸顺序和结构与胸腺生成素(TP)的32~36位氨基酸组成相同，是TP重要的功能活性部分，具有与TP相似的生物活性。TP5能促进胸腺和外周T细胞的分化和发育，对机体的免疫功能具有双向调节作用，能使过高或过低的免疫反应趋向正常。动物实验和临床研究证明TP5对免疫功能低下和自身免疫病患者的免疫功能具有重要的调节作用[1]。由于其生产工艺中使用了乙醚,所以应对胸腺五肽(TP5)中的残留乙醚进行定量和控制。

　　1  仪器及试剂
  　　
　　HP6890气相色谱仪，Agilent 7694E顶空进样器，FID检测器(美国惠普公司)。乙醇(分析纯，广州化学试剂厂)、乙醚(色谱纯)，超纯水(电阻率18.2MΩ.cm)；胸腺五肽(TP5)由海南某医药公司提供（批号：050101、050102、050103）。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件及顶空条件　　色谱柱：HP-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)；恒温：80℃；进样口温度：200℃；检测器(FID)温度：250℃；分流比：60：1。
  　　
　　样品瓶加热温度：85℃；平衡时间：30min；样品环温度：90℃；样品转移线温度：90℃；加压时间：0.1min；进样时间：1min。

　　2.2  溶液及试样制备

　　2.2.1  内标溶液制备  精密量取乙醇10.00mL（7.8900g）于100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为内标贮备液。精密量取内标贮备液25.00mL，于250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为内标溶液。此内标液中乙醇的浓度为7.8900mg/mL。

　　2.2.2  对照品溶液制备  精密量取乙醚1.00mL(0.7810g )，置于50mL量瓶中，加水溶解后稀释至刻度，摇匀，作为乙醚对照品贮备液。精密量取乙醚对照品贮备液5.00mL，置于50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为乙醚对照品溶液。乙醚对照品溶液中乙醚的浓度为1.5620mg/mL。

　　2.2.3  对照品试样制备  精密量取乙醚对照品溶液0.75mL，内标溶液2.00mL，置于5mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，转移到顶空瓶中，加盖密封，作为对照品试样。

　　2.2.4  供试品试样制备  取胸腺五肽约200mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，精密加入内标溶液2.00mL，加水至刻度，摇匀，转移到顶空瓶中，加盖密封，作为供试品试样。

　　2.3  线性关系  精密量取乙醚对照品溶液0.25，0.40，0.50，1.00，1.50，2.00mL，分别置于6个10mL量瓶中，再分别加入内标溶液4.00mL，加水至刻度, 摇匀，制成一系列浓度的混合对照品溶液。分别置于5mL顶空瓶中，加盖密封，于气相色谱仪测定。以对照品与内标物峰面积比为纵坐标(y)，对照品溶液浓度为横坐标(x )，进行线性回归得乙醚的回归方程：y=3.0209x-0.0316, 相关系数 r=0.9994。乙醚的线性范围为0.0178～0.1426mg/mL,  结果见表1。

　　表1  回归方程和相关系数结果（略）
　
　　2.4  最低检测浓度  用对照品溶液逐步稀释进样，测得乙醚的最低检出浓度(S ／ N=3)为0.82μg/mL。

　　2.5  精密度实验　　精密量取乙醚对照品溶液1.50mL，置于10mL量瓶中，再分别加入内标溶液4.00mL，加水至刻度, 摇匀。分取置于5mL顶空瓶中，加盖密封，于气相色谱仪测定。结果经6次平行测定，峰面积比分别为0.2892、0.2876、0.2866、0.2905、0.2889和0.2897，RSP为0.49%。

　　2.6  回收率实验　　取已准确测定乙醚含量的胸腺五肽约200mg，共9份，精密称定，置于9个10mL容量瓶中，分为3组，每组3份，每组分别精密加入乙醚对照品溶液各0.50、1.00、2.00mL，然后加入4.00mL内标溶液，用超纯水定容， 摇匀，按“2.1”条件测定，测得乙醚的平均回收率为95.77%，RSD为0.9%。

　　2.7  样品测定　　按“2.2.4”项制备供试品试样，按“2.2.3”项制备对照品试样，分别测定，记录色谱图，按内标法以峰面积之比计算乙醚含量，结果见表2，内标物乙醇、乙醚对照品及样品色谱图见图1~3。

　　表2  胸腺五肽中乙醚残留量测定结果（略）

　　图1  内标物乙醇色谱图（略）

　　图2  内标物乙醇、乙醚对照品色谱图（略）

　　图3  样品色谱图（略）

　　3  讨论

　　3.1  本法采用顶空进样方式，不污染色谱柱， 无需对样品进行复杂的预处理[2]。在顶空分析法中，一般情况下平衡温度越高，分析灵敏度也就越高，然而过高的温度会造成顶空气体压力过高，当手动采样时，注射器离开样品瓶的瞬间，针尖的压力降为大气压，会造成一部分样品从针尖逸失，反而使灵敏度下降，且增大了分析误差[3]。在本实验中采用85℃的平衡温度，压力适中，灵敏度亦能满足要求。

　　3.2 《中华人民共和国药典》2005年版规定的乙醚限度为0.500%[4]。本试验测定三批样品的乙醚残留量均符合要求。

【参考文献】
  　　［1］ 蒋定文 . 胸腺五肽研究进展［J］ . 《国外医学》预防、诊断、治疗用生物制品分册，1999，22(2):69～72.

　　［2］ 赵民喜，石晓晶 . 顶空气相色谱法测定盐酸喹那普利中乙醚残留量［J］ . 沈阳药科大学学报，2004，21(3):205～206.

　　［3］ 王建军，杨敏，等. 顶空毛细管气相色谱法测定环磷腺苷有机溶剂残留量［J］ . 医药导报，2006，26(11):1361～1362.

　　［4］ 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典(二部)［Z］ . 北京:化学工业出版社，2005:56.

作者单位：( Hainan university Haikou 570208, Hainan, P. R.China )