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【摘要】 目的：探讨Th1／Th2极化改变与儿童cITP之间关系。方法：采用流式细胞仪对21例cITP患儿治疗前后和28例健康者外周血CD3+CD8- 细胞内IFN-γ和IL-4进行分析。结果：cITP患儿治疗前Th0、Th1细胞和Th1/Th2比值较对照组显著降低（P<0.01），治疗后Th0、Th1细胞和Th1/Th2比值较治疗前显著增高（P<0.01），Th2细胞无明显差别 (P＞0.05)，与对照组比较，治疗后cITP患儿Th0、Th1细胞增高(P<0.05)，Th2细胞和Th1/Th2比值无显著差异 (P＞0.05)。结论：cITP患儿起病时表现为Th1 减低，Th2相对优势表达，治疗有效者表现为Th1显著增高，Th2无改变，cITP起病时Th1分泌的IFN-γ分泌减少可促进产生自身抗体，糖皮质激素治疗主要通过增加IFN-γ的分泌达到治疗目的。
【关键词】 血小板减少性紫癜；特发性；Th1细胞；Th2细胞；细胞流式细胞术
The expression of IFN-γ、IL-4 in the cells in the children with
chronic idiopathic thrombocytopenic purpura
YOU Wei-wen1, CAI Yun1, DU Xin2, et al
(1.Department of hematological disease, Shenzhen secondary people hospital, Shenzhen 518035, China;
2.Shenzhen institute of hematological disease)
【Abstract】 Objective：To study the role of Th1/Th2 polarization in children chronic idiopathic thrombocytopenic purpura (cITP). Methods:21 children of cITP and 28 healthy controls were detected for intracellular factors(IFN-γ、IL-4) in CD3+CD8- cells by flow cytometry before and after the treatment.Results: Th0、Th1 and the Th1:Th2 ratio decreased significantly(P<0.01) in cITP pretreatment compare with controls, in the patients after treatment, Th0、Th1 were higher than the patients of cITP pretreatment(P<0.01) and the controls(P<0.05), while Th2 and Th1:Th2 ratio had no difference.Conclusions: Our results suggest that the patients of cITP in children have remarkable immunity disorder before treatment; corticoid could induce immune imbalance recovery of Th1/Th2.
【Key words】 Thrombocytopenic purpura；Idiopathic；Th1 cells；Th2 cells, Flow cytometry
特发性血小板减少性紫癜（ITP）是一种临床上常见的出血性疾病，其特点是血小板寿命缩短，骨髓内巨核细胞数正常或增多，患者血清或血小板表面常存在血小板表面抗体，缺乏外源或继发性因素。儿童ITP分为急性型和慢性型（cITP）。cITP的病因与免疫有关，体液免疫是其中心环节。
在体液免疫中起主要作用的CD4+T细胞能促进B细胞、T细胞和其他免疫细胞的增殖、分化，协调免疫细胞间的相互作用。研究发现，人类CD4+T细胞按分泌细胞因子的不同可分为Th0、Th1、Th2和Th3亚群，其中受抗原刺激前的Th细胞为Th0细胞，Th0细胞经抗原刺激后，在多种因素综合作用下发生功能极化，分化成Th1、Th2细胞，Th3细胞为某些口服抗原（如卵蛋白）诱导肠道免疫组织分化出一种特殊类型的Th2细胞。研究发现，Th1/Th2细胞极化维持在一定范围内, Th1/Th2分化表达异常在自身免疫性疾病诱导、发展中起着关键作用［1］。本实验通过四色流式细胞仪检测cITP患者外周血单个淋巴细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4的表达情况，以探讨Th1／Th2功能极化与cITP治疗疗效关系。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 细胞刺激和阻断剂：佛波酯乙醇（PMA）、离子霉素（ionomycin）、莫能霉素（monensin）均为Sigma公司产品，四色单抗CD3-TC、CD8-ECD、IL-4-PE、IFN-γ-FITC及PE、FITC标记的同型对照鼠IgG单抗为Caltag Laboratories 产品，细胞固定、破膜剂为An Der Grub公司产品，RPMI medium 1640为Gibco Laboratories生物技术公司产品。流式细胞仪为Beckman coulter公司Epics XL型。
1.2 临床资料 21例ITP患儿，男12例，女9例，年龄5~14岁，平均11.05岁，追踪病史均＞1年且血小板计数仍低于50×109/L的ITP患儿，治疗前血小板数4~36×109/L，平均12×109/L，诊断符合张之南主编的血液病诊断及疗效标准，分型参照《实用内科学》第十一版。确诊后予以甲基强地松龙10~20 mg/（kg·d），冲击治疗3天后改为口服强的松1 mg/（kg·d）并依据病情调整剂量。在治疗前、经治疗血小板计数恢复正常及强的松减量后复查CD3+CD8-细胞内IFN-γ、IL-4水平。对照组为28例健康儿童，男17例，女11例，年龄6～14岁，平均10.68岁，血小板计数在正常水平。
1.3 单个核细胞内细胞因子方法的检测 无菌采集肝素抗凝静脉血100 μL，加100 μL RPMI1640液，然后依次加入0.1 μg/mL佛波酯乙醇12 μL、1 μg/mL离子霉素4 μL、1 mg/mL莫能霉素 3.4 μL。在37 ℃、5％CO2环境下培养4小时，将样本平均分为A、B两管，各加入抗CD3、CD8单抗37 ℃避光孵育15 min，加固定剂A 200 μL 37 ℃避光孵育15 min，加PBS 3mL震荡、1 200 r/min离心5 min，弃上清液，然后 A管加破膜剂B 100 μL、抗IFN-γ、IL-4单抗，B管加破膜剂B 100 μL、同型对照IgG单抗，37 ℃避光孵育15 min，PBS洗涤、离心、弃上清液，最后以PBS悬浮细胞，以流式细胞仪检测样本单个核细胞中能合成IFN-γ、IL-4的CD3+CD8-细胞百分数。
1.4 统计学处理 数据用均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用t检验分析。
2 结果
cITP患儿发病时分泌IFN-γ的CD3+CD8-细胞（Th1）较健康对照者显著降低(P<0.01)，而分泌IL-4的CD3+CD8-细胞（Th2）与对照组比较无差异 (P＞0.05)，Th1/Th2比值显著降低(P<0.01)，Th0值也较健康者显著降低(P<0.01)。
cITP患者治疗后分泌IFN-γ的Th1细胞较治疗前显著增高(P<0.01)， Th2细胞无显著差异 (P＞0.05)，Th1/Th2比值显著升高(P<0.05)，Th0值也较健康者升高(P<0.05)。
与对照组比较，治疗后cITP患者Th0、Th1细胞增高(P<0.05)，Th2细胞无显著差异 (P＞0.05)，Th1/Th2比值升高(P<0.05)，见表1。表1 cITP患儿糖皮质激素治疗前后与对照组Th1/Th2极化表达△：P＜0.01，P＜0.05，与对照组比较；*：P＜0.01，**：P＜0.05，与治疗前比较。
3 讨论
目前有关Th1／Th2细胞极化在ITP发病机制中的作用尚未有明确结论，既往多通过ELISA方法检测血清中细胞因子水平，对Th1/Th2亚群进行推测分析。Semple及Garcia-Suarez等的实验显示在儿童cITP中IL-2、IFN-γ、TNF-β高表达， IL-4、IL-6低水平表达，提示儿童cITP存在早期Th细胞激活反应［2-4］，而 Webber、Kimura和Crossley等的实验显示在cITP患者中IL-4、IL-6、IL-10水平较正常人明显升高，IL-2、IFN-γ低水平表达［5-7］，但也有ELISA方法的实验发现cITP患者血清中IL-2、IFN-γ、IL-10水平与健康对照无差异，IL-6水平明显受抑，低于可检测范围［8］。由于细胞因子具有多细胞来源的特点，因此ELISA方法存在细胞因子的来源不明确，实验结果容易受到其他因素的干扰。
正常情况下，细胞内细胞因子含量低，不能足够表达，随着免疫学技术的发展，外周血单个核细胞在佛波酯乙醇（PMA）刺激下胞浆内细胞因子合成放大，莫能霉素使细胞因子聚集在高尔基体，离子霉素阻止胞浆内细胞因子的分泌释放，使胞浆内细胞因子有足够表达，结合短时间的固定、破膜打孔技术，通过流式细胞仪可以从单个细胞水平同时检测细胞浆内多种细胞因子，区分不同细胞亚群［9,10］。由于Th1、Th2细胞表达细胞因子的非随意性，IFN-γ和IL-4互相排斥分泌表达，临床研究用产生IFN-γ或IL-4的CD4+T细胞（Th细胞）代表Th1或Th2细胞。由于CD4+同时在部分T淋巴细胞、单核细胞、胸腺细胞和某些B细胞表达，而且PMA在体外对Th细胞表面CD4分子表达有明显下调作用［11］，我们参照Maino VC和Rostaing L的实验［9,10］采用CD3+CD8-设门表达CD4+T细胞，减少非CD4+T细胞的干扰和PMA对CD4+抗原表达的影响。
本结果显示，代表Th1细胞的IFN-γ在儿童cITP组治疗前的表达明显低于正常对照组，而代表Th2细胞的IL-4的表达与正常组比较无差异。提示患儿发病时外周血Th0细胞向Th1细胞的分化明显减少，而Th2细胞相对增加，呈现Th2优势表达，提示产生Th1向Th2漂移，经糖皮质激素治疗缓解后，患儿外周血CD3+CD8-细胞合成、分泌IFN-γ的水平明显升高，而Th2表达无变化，表明糖皮质激素通过解除对Th1的抑制以逆转Th1／Th2表达失衡。与此相反，王宁玲等［12］通过流式细胞术检测儿童ITP患者的CD4+细胞IFN-γ、IL-4的表达，结果显示在ITP患儿中Th1优势表达。其实验结果的异质性可能与病例选择有关，儿童ITP分为急、慢性两种类型，急性多见，占85%，其病例选择以急性ITP为主，急性ITP多继发于上呼吸道感染后，预后良好，血小板计数多能恢复正常，其发病机理、病程及预后与慢性ITP存在较大差异，我们的实验结果提示儿童慢性ITP的Th1／Th2极化表达与成人慢性ITP的Th1／Th2极化表达相类似［13］，均呈现Th1型细胞因子（IFN-γ）表达低下。
【参考文献】
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作者单位：深圳市第二人民医院血液科，广东 深圳 518035