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【摘要】 目的：研究低氧预处理对缺血脑组织热休克蛋白70(HSP 70)表达的影响，探讨低氧预处理的脑保护机制。方法：30只SD大鼠，体重在200～230克，随机分为3组：假手术组(n=10)，脑缺血组(n=10)，低氧预处理组(n=10)。分别观察3组动物的神经功能评分，按Bederson 6级5分制方法进行，用免疫组化法检测大鼠脑组织凋亡细胞和HSP 70蛋白表达。结果：假手术组的神经功能评分为(0.00±0.00)分，脑缺血组为(2.40±0.97)分，低氧预处理组为(1.40±0.84)分，低氧预处理组与缺血组神经功能评分有统计学差异；预处理组的病变侧海马凋亡细胞数明显少于缺血组而HSP 70蛋白表达明显高于缺血组，两组相比较统计学差异有显著性。结论：低氧预处理能减轻缺血后的细胞凋亡,对脑缺血具有保护作用，其机制可能是增加HSP 70蛋白的表达来实现的。
【关键词】 低氧预处理 脑缺血 HSP 70 凋亡细胞
脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点，在我国死亡原因中占第二位，其中缺血性脑血管病占了70%以上［1］。缺血性脑血管疾病如脑梗死等极大地危害着人民群众的健康，本实验通过大鼠大脑中动脉线栓法局灶性缺血模型研究低氧预处理对脑缺血的保护作用，同时探讨热休克蛋白70(HSP 70)在这种保护作用中发挥何种作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组
健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重200～230克，雌雄不拘，由锦州医学院动物中心提供。分3组，分别为假手术组、缺血组和预处理组，每组10只。
1.1.2 试剂
原位杂交检测试剂盒(HSP 70)DBA显色试剂盒，SABC试剂盒等，均购自武汉博士德生物有限公司，原位细胞凋亡检测试剂盒：武汉博士德生物制品有限公司，平衡液，0.1M PBS，10%水合氯醛，4%多聚甲醛液。
1.1.3 仪器
石英自动双重纯水蒸馏器：江苏丹阳门石英玻璃厂，LEICA-RM-2135 石蜡切片机：德国，烘片、烤片机：孝感市电子仪器厂，恒温水浴箱：湖北黄石仪器厂，恒温培养箱：上海嘉程仪器厂，OLYMPUS 万能显微镜：日本。
1.2 方法
1.2.1 大脑中动脉缺血模型
应用改进的Longa’s方法，建立阻断右侧大脑中动脉局灶脑缺血模型(MCAO)。
1.2.2 低氧预处理动物模型
按照吕国蔚方法，将SD大鼠称重后放入经标定的1 000 ml的广口瓶内密闭，在瓶内装入20克钠石灰，用以吸收大鼠呼出的二氧化碳和水分，一旦大鼠出现喘式呼吸时立即取出，并随即放入另一个含有新鲜空气的同样瓶内，如此重复4次。结束后饲养24小时再进行上述缺血处理24小时。
1.2.3 假手术组
SD大鼠用平衡液麻醉后，于颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉后缝合皮肤。24小时后断头取脑。
各组动物模型在规定时间点处死，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用4%多聚甲醛液透心灌流内固定然后断头取脑，再用10%甲醛对脑组织行外固定。取前囟后4 mm脑组织，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片 (片厚 5 μm), 分别细胞凋亡检测和HSP 70免疫组化染色。
1.2.4 细胞凋亡的检测（TUNEL法）
TUNEL染色步骤：取前囟后4 mm脑组织外固定，石蜡包埋切片，切片厚度5 um，各组相应部位切片贴附于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，置烤箱内烘烤60分钟，37 ℃过夜。切片常规脱蜡入水，新鲜配制3%H2O2-甲醇液,室温处理10分钟，蒸馏水洗涤3次，每次2分钟。TBS 1：200新鲜稀释ProteinaseK 37 ℃消化15分钟，然后TDT和DIG-DUTP标记缓冲液标记，样品于湿盒中4 ℃过夜，后经封闭液封闭、抗地高辛抗体处理、DAB显色、苏木素轻度复染、脱水、封片、显微镜观察。
1.2.5 HSP 70蛋白免疫组织化学检测
检测试剂盒由武汉博士德生物试剂公司提供。石蜡切片常规脱蜡至水，按照试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。
1.2.6 资料分析及统计学处理
采用SPSS 10.0软件中程序进行分析，计量资料均用x±s表示，显著性差异用组间差异t检验，P＜0.05为差异显著性指标。
2 结果
2.1 神经功能缺损程度
假手术组为(0.00±0.00)分；缺血组2只1分、3只2分、4只3分、1只4分，平均(2.40±0.97)分；预处理组1只0分、5只1 分、3只2分、1只3分，平均(1.40±0.84)分。预处理组神经功能评分与缺血组比较有显著性差异(P<0.05)。
2.2 细胞凋亡的检测结果
假手术组的大脑半球未检测到凋亡细胞；缺血组在缺血侧海马可见散在的凋亡细胞，呈棕色，细胞质均匀浓缩，核深染，轮廓清晰，细胞体积较小，且可见少数大小不等的深棕色圆形小体，形似凋亡小体；预处理组亦在缺血侧海马检测到凋亡细胞，形态与缺血组相似，但细胞计数为(10.72±1.34)个/高倍视野，显著少于缺血组的(13.44±1.02)个/高倍视野(P<0.01)。
2.3 HSP 70免疫组化结果
假手术组未见HSP 70表达，缺血组在缺血侧脑组织中可见HSP 70表达，HSP 70位于细胞胞浆中，呈棕色，预处理组HSP 70与缺血组比较明显增多，染色偏深。阳性细胞计数为(23.44±1.84)个/高倍视野,显著高于缺血组的(21.14±1.04)个/高倍视野(P<0.01)。
3 讨论
低氧预处理是指机体预先经受一定程度短暂的、非致死性低氧之后，再恢复常氧状态，如此反复多次刺激使机体对低氧产生适应性的过程。低氧预适应可以提高机体对进一步低氧或缺氧的耐受能力，即低氧或缺氧耐受性。本实验中，低氧预处理组大鼠神经功能评分明显优于缺血组，有显著性差异，这进一步证明低氧预处理对脑缺血性损伤有保护作用。
细胞死亡可分为坏死和凋亡两种方式，细胞凋亡(apoptosis)又称程序化细胞死亡(programmed cell death, PCD)，是在基因调控下逐步走向死亡的过程，是美国病理学家Kerr等于1972年首先提出的。传统上认为脑缺血中细胞坏死占主导，近年在脑缺血的动物模型和细胞培养中发现凋亡及抗凋亡信号瀑布式激活现象表明，在脑缺血中存在凋亡［2］。这种死亡是以核染色质固缩、细胞器萎缩、细胞体积缩小为特征的。电镜下表现为细胞器正常的胞浆浓缩，核通常皱缩，染色质固缩并碎裂成靠近膜的碎片，最后分裂成几个致密小体即凋亡小体。这些变化是识别凋亡的标志，同时也导致凋亡细胞被周围细胞所吞噬。本实验TUNEL染色显示阳性信号在核内分布，核边界清晰，大小不一，阳性信号呈棕色至深棕色。缺血组凋亡细胞数较多，核固缩、溶解，部分细胞结构破坏，在形态学上更符合坏死改变，而进行低氧预处理后，细胞形态基本正常。凋亡细胞数量较缺血组减少。
生物体在遭受温度变化、低血糖、缺血缺氧、麻醉剂、机械创伤等各种不良因素刺激时，能够迅速产生应激蛋白-热休克蛋白，这一过程称作热休克反应(heat shock reaction, HSR)，是机体在不良刺激下的基本防御反应［3］。因此，HSP是机体的重要防御因子，具有保护机体(或细胞)免受或少受伤害的作用。本实验中，低氧预处理组HSP 70表达明显升高，高于缺血组，具有显著性差异，这说明在低氧预处理的保护机制中HSP 70也发挥一定的作用。
综上所述，我们认为低氧预处理对缺血脑组织有保护作用。其机制可能为通过调节凋亡相关基因，如减少抑制性基因p53蛋白表达，增加保护性基因HSP 70表达，以延迟伤后神经细胞的凋亡。
【参考文献】
［1］王忠诚.脑血管病及其外科治疗［M］.北京：人民卫生出版社，1994，12.
［2］Lipton P. Ischemia cell death in brain neurons［J］.Physiol Rev，1999,79(4):1431-1568.
［3］Petra M. Induction of heat shock protein 70 in the rat brain following intracisternal infusion of autologous blood:evaluation of acute neuronal damage［J］. J Neurosurg，1999，91:843-850.
作者单位：1.葫芦岛市中心医院神经内科，辽宁 葫芦岛 125000；2.辽宁医学院附属第一医院神经内科