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【摘要】 目的：探讨依达拉奉抗癫痫的机制。方法：应用SP法研究戊四氮致癫痫大鼠和褪黑素抗癫痫大鼠海马谷氨酸受体ζl（N-methyl-D-aspartate recepterζl ，NMDAζ1）和，γ-氨基丁酸受体Aαl (γ-aminobutyric acid-A recepterαl, GABAARαl)的变化。结果：海马NMDAζ1的表达在戊四氮致癫痫组明显高于正常对照组（P<0.01），依达拉奉抗癫痫组明显低于戊四氮致癫痫组（P<0.01），依达拉奉抗癫痫组与正常对照组之间差异无显著性意义（P>0.05）；海马GABAARαl的表达在戊四氮致癫痫组明显低于正常对照组（P<0.01），依达拉奉抗癫痫组明显高于戊四氮致癫痫组（P<0.01），依达拉奉抗癫痫组与正常对照组之间差异无显著性意义（P>0.05）。结论：依达拉奉可能通过抑制海马兴奋性神经递质受体NMDAζ1和激活海马抑制性神经递质受体GABAARαl的活性与表达，降低大脑皮质的兴奋性，抑制癫痫的形成及发展来发挥抗癫痫作用。
【关键词】 癫痫；依达拉奉；N-甲基-D-天冬氨酸受体；γ-氨基丁酸受体；戊四氮
A lnfluence of edaravone on amino acid receptor in hippocampus of pentylenetetrazole-induced epileptic rats
DUAN Chang-feng, CHENG Yang-lin, WANG Zhi-feng, et al
Department of Neurology, The First Hospital Of Jingzhou (Yangtze university clinical medical college)
【Abstract】Objective：To explore the possible antiiepileptic mechanism of edaravone. Methods:The expressions of N-methyl-D-aspartate receptorζl（NMDAζ1）and γ-aminobulyric acid-A receptorαl（GABAARαl）in the hippocampus of pentylenetetrazole(PTZ)-induced epileptic rats and epileptic rats treaded with edaravone were determined by SP method.Results: The expression of NMDAζ1 in the hippocampus of PTZ group rats was higher than that of control group rats. After treatment with edaravone,the NMDAζ1 expression was decreased significantly. There was no significant difference in the expression of NMDAζ1 between the rats of edaravone group and normal control group. The expression of GABAARαl in the hippocampus of PTZ group rats was lower than that of control group rats. After treatment with edaravone, the expression of GABAARαl was increased significantly.There was also no significant difference between the rats of edaravone group and normal control group.Conclusions: edaravone may reduce the excitability of cerebral cortices by inhibiting the activities of NMDAζ1 and by promoting the activities of GABAARαl in the hippocampus, so the development and formation of epilepsy are inhibited.
【Key words】epilepsy; Edaravone；N-methyl-D-aspartate recepterζl；γ-aminobutyric acid-A recepterαl；Pentylenetetrazole
癫痫是多种机制相互作用,发病形式多样的慢性临床综合征,临床治疗困难，目前研究认为,氧化应激自由基损伤在癫痫的发生、发展中起重要作用［1,2］。我们认为自由基在癫痫病理过程中可能是与氨基酸递质相互作用、相互促进，在癫痫中加重脑组织损伤。为了进一步验证此假设，我们设计此实验，采用免疫组化的方法观察自由基清除剂依达拉奉对癫痫发作大鼠海马谷氨酸受体ζ1（N-methyl-D-aspartate recepterζl,NMDAζ1）和γ-氨基丁酸受体Aαl（γ-aminobutyric acid-A recepter αl, GABAARαl）的影响，分析依达拉奉与癫痫发作时中枢神经系统氨基酸递质的关系，以期反证自由基在癫痫发病中的作用，并近一步探讨依达拉奉抗癫痫的深层机制，为癫痫的治疗寻找更多的途径。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
戊四氮及多聚甲醛均为Sigma公司产品，兔抗NMDAζ1和GABAAR αl抗体购自Santa Cruz公司，wistar大鼠由长江大学医学院动物中心提供（清洁级），羊抗兔抗体和DAB染色剂由迈新公司提供，依达拉奉由南京先声药业有限公司生产。
1.2 动物
1.2.1 动物的分组与处理
健康雄性Wistar大鼠36只，体质量280～340 g。动物饲养及分组:提前1周将大鼠饲养在12 h光照（7:00～19:00）12 h黑暗（19:00～7:00）安静的环境下，自由摄食饮水，温度（24±2） ℃。将36只大鼠单纯随机分为:PTZ致癫痫组（PTZ组）； 依达拉奉抗癫痫组（ED+PTZ组）;正常对照组（N组）;每组各12只。
1.2.2 实验动物的处理
PTZ组:用与依达拉奉等量的生理盐水于腹腔注射PTZ （50 mg/ kg）前60 min、30 min、立即分别腹腔注射，后观察1 h。模型成功与否以其发作时的行为变化为主要依据，按Ravine分级:0级，无任何反应；1级，面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；2级，1级加节律性点头；3级，2级加前肢阵挛;4级，3级加后肢站立；5级，4级加摔倒。ED+PTZ组:按体质量3 mg/kg于腹腔注射PTZ（50 mg/kg）前60 min、30 min、立即分别腹腔注射依达拉奉并观察1 h。N组: 用与依达拉奉等量的生理盐水于腹腔注射生理盐水(与PTZ等量) 前60 min、30 min、立即分别腹腔注射，后观察1 h。
1.2.3 灌注与取材
观察完成后灌注，暴露心脏，直视下将穿刺针经左心室刺入并减开右心耳，先用冷生理盐水100 mL快速灌注，再灌注含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液500 mL，共灌注时间为1 h，开颅取脑，修块后置于上述灌流液内4 ℃过夜，再置于200 g/L蔗糖中12 h，然后常规脱水、透明、浸蜡、包埋。切片厚度4 μm。
1.2.4 免疫组织化学方法
石蜡切片常规脱蜡至水，置0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中微波修复10 min每张切片上滴加50 μl 1g/L Triton溶液37 ℃孵育10 min， PBS洗3 min×3次，滴加封闭用动物血清，37 ℃孵育15 min滴加NMDAζ1兔抗(1: 100)或GABAAR al兔抗(1: 3000 4 ℃孵育过夜，PBS洗5 min×3次，滴加生物索标记山羊抗兔IgG,37 ℃孵育20 min，PBS洗3 min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min， PBS洗3 min×3次，然后DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
1.2.5 统计学分析
应用统计学处理软件SPSS 13.0进行数据处理。每只鼠随机选取3张切片，这些切片的断面水平在各鼠均相似，每张切片的每个区域随机选择3个高倍视野进行测定。对所选脑区运用HPIAS-200型图像分析软件进行阳性反应细胞平均度和阳性神经细胞数。数据以x±s表示，组间比较应用方差分析，两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 行为变化
PTZ组鼠给药以后平均56 second左右出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、节律性点头、肢体抽搞、跌倒等表现，其中9只出现5级发作，2只出现4级发作，1只出现3级发作。ED+PTZ组鼠给药以后平均12 min左右出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、节律性点头、肢体抽搐等表现，其中1只出现4级发作，1只出现3级发作，7只出现2级发作，3只出现3级发作。N组给药前后均无明显变化。
2.2 免疫组织化学结果海马NMDAζ1和GABAARαl阳性反应细胞平均吸光度和阳性神经细胞数比较分别见表1、2。免疫反应的强弱用平均吸光度值表示，数值越大颜色越深。表1 大鼠海马NMDAζ1阳性细胞数和阳性反应细胞平均吸光度值（略）表2 大鼠海马GABAARαl阳性细胞数和
阳性反应细胞平均吸光度值（略）
3 讨论
癫痫发病机制复杂，近年来，越来越多的研究表明机体代谢过程中产生的大量自由基及其脂质过氧化作用参与了癫痫发病的病理过程，自由基能攻击多不饱和脂肪酸(PUFA)引发脂质过氧化作用，脂质过氧化作用形成的脂氢过氧化物，在过氧化条件下易分解生成丙二醛(MDA)及新的氧自由基等复杂产物, MDA能从它生成的部位扩散到其他细胞成分，甚至能从细胞逸出，带着自由基的损伤潜能到其他细胞，继而引起细胞代谢和功能障碍，参与癫痫对脑的损伤［3］。但是自由基是以何种机制参与癫痫的病理过程，目前还不是很清楚，我们推测可能是过量产生谷氨酸和减少γ-氨基丁酸的释放，导致脑损伤发生。为了证实此假设，我们设计此实验，采用免疫组化的方法观察自由基清除剂依达拉奉对癫痫发作大鼠海马谷氨酸受体ζ1和γ-氨基丁酸受体Aαl的影响，以期反证自由基分与癫痫发作时中枢神经系统氨基酸递质的关系，并近一步探讨依达拉奉抗癫痫的深层机制，为癫痫的治疗寻找更多的途径。
正常脑的功能取决于兴奋性与抑制性活动的相互影响，癫痫发作的产生是神经元反复阵发性过度发放的结果，这些异常发放是因为脑内兴奋系统及抑制系统的失平衡而产生的。兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸比例失衡是癫痫发病的重要机制。谷氨酸是中枢内重要的兴奋性神经递质，它导致的神经元兴奋性活动是由不同的亚型受体介导［4］。GABA是中枢神经系统最重要的抑制性神经递质，在阻断兴奋的扩散和传导过程中起决定性作用，GABA的合成减少，可使神经元的抑制降低，从而使神经元的兴奋得不到正常的控制，导致癫痫的发作。本实验结果显示腹腔注射致痫药PTZ的大鼠与正常对照组大鼠相比，海马NMDAζ1的表达增加、GABAARαl表达减少，进一步证实海马NMDAζ1的上调和GABAARαl的下调在癫痫发生密切相关。
同时在我们的实验中还发现，经过依达拉奉处理的大鼠与PTZ组大鼠相比，在痫性发作减轻的同时，NMDAζ1表达明显减少、GABAARαl表达明显增加，表明依达拉奉后不仅抑制了自由基的生成，还通过抑制海马兴奋性神经递质受体NMDAR的活动、增加抑制性神经递质GABA受体的活动降低大脑皮质的兴奋性，从而提高癫痫发作的阈值、抑制癫痫的形成及发展；同时从另外一方面反证自由基也通过增强海马兴奋性氨基酸受体的活动、降低抑制性氨基酸受体的活动而促进癫痫的发生与发展。自由基主要通过灭活谷氨酰胺合成酶来促进兴奋性神经递质谷氨酸的异常增加，同时抑制了L-谷氨酸脱羧酶的活性，使抑制性神经递质γ氨基丁酸降低来发挥作用，而依达拉奉可能通过清除自由基，降低谷氨酸的作用，增强γ氨基丁酸的作用而发挥抗癫痫作用，但是否依达拉奉可以直接作用于NMDAζ1和GABAARαl受体，这还要需要我们在下一步的离体实验中进一步证实。
同时在我们的实验中还发现经过依达拉奉处理后的PTZ致痫大鼠和正常对照组大鼠相比，NMDAζ1及GABAARαl的表达无显著性差异，表明依达拉奉并不会过度影响脑内神经递质的平衡和脑功能的稳定性，证明依达拉奉的临床应用是安全的。
总之，由本试验可以看出，自由基可以通过增强海马兴奋性神经递质受体NMDAζ1和抑制海马抑制性神经递质受体GABAARαl的活性而参与癫痫的发生与发展，而应用自由基清除剂可以降低大脑皮质的兴奋性，抑制癫痫的形成及发展，作为癫痫的重要辅助治疗措施之一。
【参考文献】
［1］Frantseva MV, Perez Velazquez JL, Hwang PA, et al. Free radical production correlates with death-in an vitro model of epilepsy［J］.Eur Neurosci,2000,12(4):1431-1439.
［2］Costello DJ,Delanty N. Oxidative injury in epilepsy: potential for antioxidant therapy? ［J］.Expert Rev Neurother,2004,4(3):541-553.
［3］Costello DJ, Delanty N. Oxidative injury in epilepsy: potential for antioxidant therapy? ［J］.Expert Rev Neurother,2004,4(3): 541-553.
［4］李敏、黎海蒂、汪涛、等.谷氨酸及其N-甲基-D-天冬氨酸受体α1在大鼠前额叶执行控制中的作用机制［J］.中国临床康复，2003,7(31):4202-4204.
作者单位：1.长江大学附属第一医学院 神经内科，湖北 荆州 434000；2.荆州市捐血中心；3.荆州市中医院