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关键词 外周血单个核细胞 巨噬细胞 胰腺癌 PC-3 杀伤作用
IL-18gene can enhance the nonspecific cellular immunity
of mice to the pancreatic cancer cell line
Ni Xiaoling，Jin Dayong，Lou Wenhui，et al.
General Surgery，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To study the killing potential of macrophage and peripheral blood mononuclear cell（PBMC）to cell line PC-3transfected with IL-18.Methods After ConA injection of mouse abdomen，the macrophages were separated and ten cultured in vitro.PBMC was acquired by acquired from the blood of peripheralblood of nude mice.PC-3cells were transfected with IL-18.expressing plasmid or the control vector by liposome transfection.The expression of those genes was measured by western blot analysis.The potential of tumor immune reguˉlation by IL-18was evaluated macrophage cytotoxicity with the calcein-AM release method.Results The killing potential of macrophage and PBMC to PC-3cells transfected with and IL-18was significantly higher than that of cells transfected with control vector（P<0.001）.Conclusion IL-18could enhance the killing potential to PC-3cell bymacrophage.Therefore，it is suggested that mIL-18be used as immune therapy of pancreatic cancer.
Key words PBMC macrophage pancreatic cancer PC-3 cytotoxicity
肿瘤的发生是由机体的免疫监视和防护功能失常引起的，胰腺癌恶性程度高，迄今治疗效果差，手术切除仍然是主要治疗手段，5年生存率低 ［1］ ，其生长、扩散很大程度决定于机体防御系统的状态。如何增强机体的免疫功能，尤其是细胞免疫对提高肿瘤的局部控制率、远期生存率及降低复发率有重要作用。其中的非特异性细胞免疫包括巨噬细胞、单核细胞及自然杀伤细胞（NK细胞）构成了机体抵抗肿瘤的第一道防线，研究表明，NK细胞对杀伤循环系统中的肿瘤细胞、防止肿瘤细胞经血行播散起着重要作用;巨噬细胞会趋向于已被抗体包裹的肿瘤细胞、增强NK细胞的作用。而以特异性的细胞因子促进免疫细胞增殖并提高其功能，有可能达到增强宿主抗肿瘤免疫的目的。本实验研究小鼠巨噬细胞和裸鼠外周血单个核细胞（PBMC）对转染细胞介素18（IL-18）基因后的胰腺癌细胞系PC-3的杀伤作用，从而评价该细胞因子基因的作用。
1 材料与方法
1.1 IL-18基因转染PC-3胰腺癌细胞株
1.1.1 胰腺癌细胞株的培养 胰腺癌细胞株PC-3（复旦大学胰腺癌诊治中心）在37℃、5%CO2 培养箱中用含10%胎牛血清和青霉素100IU/ml链霉素100μg/ml、5.6%NaHˉCO3 、pH值为7.2的BMPI-1640（Gibco BRL公司）中培养，3天传代一次。
1.1.2 质粒扩增、纯化 制备感受态大肠杆菌Top10F（复旦大学分子病毒学重点实验室），将pCDNA3.1质粒、pCDˉNA3.1-mIL-18（复旦大学分子病毒学重点实验室）转化入新鲜制备的感受态大肠杆菌，37℃摇振培养，使质粒大量扩增，取菌液，利用小量柱离心式质粒抽提纯化试剂盒（上海华舜生物工程公司）提取并纯化质粒。
1.1.3 基因转染 转染前24h，将4×105 个用胰蛋白酶溶液消化PC-3细胞转接于六孔板内，每孔加3ml含10%胎牛血清的1640培养液，37℃、5%CO 2 培养箱中培养。将待转染的细胞用PBS（pH7.4）洗1次。在2个1.5ml的epˉpenddorf离心管中分别将5μg空质粒pCDNA3.1、pCDNA3.1-IL-18溶于未添加血清及二抗的1640培养液中至150μl，加入20μl Fugene6脂质体，轻摇混合后于25℃下放置10min。再加入1ml完全培养液混匀。立即将混合物滴加在培养瓶中待转染的细胞表面。于CO2 培养箱中培养2h后倒掉转染液，PBS（pH7.4）洗3次。37℃，5%CO 2 下培养。1.1.4 Western blot检测 转染48h后，用PBS洗涤3次。加150μl上样Buffer，刮下细胞，收集于1.5ml eppenddorf管，沸水浴5min。高速离心3min。取30μl上样，电泳，转膜。脱脂奶粉溶于1%PBST，配成5%封闭液，封闭室温1～1.5h，用1×PBST洗涤3次。加入1:1000鼠IL-18单抗（Bioˉscience公司），4℃过夜。用1×PBST洗涤3次，再加入羊抗鼠二抗（华美公司），作1:1000倍稀释，室温作用1h。避光显色15min，用ddH 2 O冲洗干净后晾干。
1.2 小鼠免疫细胞对转染IL-18后的PC-3杀伤效应
1.2.1 靶细胞的准备 分别准备PC-3细胞、转染空质粒的PC-3细胞、转染pCDNA3.1-IL-18质粒的PC-3细胞。传代后培养24h备用。
1.2.2 CalceinAM荧光标记肿瘤细胞 用胰酶将各组PC-3肿瘤细胞消化后计数，调整浓度至1×106 /ml。每管加入CalceinAM5μl，37℃水浴40min。用Hank′s液洗涤细胞2次。荧光显微镜下计数，肿瘤细胞荧光标记率>95%备用。
1.2.3 制备裸鼠外周血单个核细胞（PBMC） 用肝素处理后的头皮针从裸鼠静脉内眦静脉内取血2～3ml。加入等体积的Hank’s液中（pH=7.2），混匀。共取3只，合并。取Ficoll液3ml/管，将血Hank’s混合液各加入Ficoll中，平衡后，放入离心机内，2500rpm×20min。用毛细吸管吸取第二层液体至一干净的试管内，加入Hank’s液至总体积为10ml。混匀后，平衡后洗涤2次，加入2ml的1640完全培基，充分吹匀细胞沉淀，取微量用1640液1:10稀释后，计数。加上0.5ml培养液。安上针套和盖上注射器套，置37℃培养箱中45min。台盼兰染色，活细胞>90%，该细胞悬液即用于PBMC杀伤实验。
1.2.4 制备巨噬细胞 提前3天往小鼠腹腔注射ConA，100μg/ml/只（Sigma公司），将小鼠引颈处死后，用酒精消毒，剪开腹部皮肤，用1ml注射器往腹腔内注射3ml无Ca 2+ 和Mg 2+ 的Hank’s液，轻揉腹部片刻。用毛细吸管吸出腹腔内液体，再用Hank’s液冲洗腹腔3次后，收集所有液体，离心。用Hank’s液洗涤细胞2次，加入无血清（无酚红）的1640培养3h。
1.2.5 PBMC杀伤实验 将标记好的PC-3肿瘤细胞按效靶比10:1和20:1并稀释成0.5ml/孔加入24孔板中，总容积至1.0ml。设IL-18组、空质粒组和对照组每组8份。37℃、5%CO 2 培养。培养24h后，每孔吸取上清200μl到96孔平底培养板中，用Fluoroskan检测上清中的荧光值。同时设立自发释放组和最大释放组（最大释放孔用1%SDS1ml/孔裂解细胞），各设3孔，取平均值。PBMC的杀伤能力=（实验组荧光组-自发释放量）/（最大释放量-自发释放量）×100%。
1.2.6 巨噬细胞杀伤实验 培养3h后的巨噬细胞，弃上清，用无血清的1640培养液洗3次，洗去未贴壁细胞后，每孔加入0.5ml无酚红的1640完全培养液。将标记好的转染不同质粒PC-3肿瘤细胞按效靶比10:1或20:1，稀释成0.5ml/孔加入24孔板中，总容积至1.0ml。设IL-18组，空质粒组，空白对照组，每组8份，37℃，5%CO 2 培养。同时设立自发释放对照孔和最大释放孔（最大释放孔用1%SDS1ml/孔裂解细胞），各设3孔，取平均值。培养48h后，每孔吸取 上清200μL到96孔平底培养板中，用Fluoroskan检测上清中的荧光值，实验组荧光值减去自发释放量，占最大释放量的百分比表示巨噬细胞的杀伤能力。
1.3 统计学分析 计量数据用ˉx±s标准差表示。所有成对资料用Independent-samplest test检验。采用SPSS10.0统计软件包分析。
2 结果
2.1 PC-3细胞株经转染mIL-18后，用Western blot检测（图1），在相应位置出现特异性条带，说明转染