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关键词 eIF4E VEGF Western-blot法 TC TR TF
Study on expression and correlation of eIF4E，VEGF
and bFGF in laryngeal squamous cell carcinoma
Wang Binquan，Zhang Haili，Chen Yanqiu.
Department of Otolaryngology，The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan030001.
【Abstract】 Objective The expression and correlation of eIF4E and VEGFwere studied by detection their exˉpression in laryngeal squamous cell carcinoma（LSCC）.Methods Western-blot analysis was performed on tumor core，transition core，“tumor-free”core of20specimens of fresh LSCC using anti-eIF4E，VEGF，bFGF antiserums.Results The expression of eIF4E protein level from“tumor-free”core，transition core and tumor core of LSCC apˉpeared progressive overexpression;It appered that there was significant elevation of the VEGF protein level in tumor core compared with tumor transition and“tumor-free”core;there appered to be statistically significantly correlation of eIF4E and VEGF expression.Conclusion Overexpression of eIF4E may be a molecular marker of malignant transforˉmation and progression;The overexpression of VEGFwas highly associated with the growth and metastasis of LSCC，and may be of prognostic value;The correlation of eIF4E and VEGF may serve as a potential target for antiangiogenic therˉapy of LSCC.
Key words eIF4E VEGF Western-blot LSCC
真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）是一25KD的多肽，其在蛋白质合成的起始阶段起重要的调控作用 ［1］ 。在正常的eIF4E低水平的情况下，肩负有“看家”功能的大多数拥有短5’非翻译区（UTR）的Strong mRNA，它们在翻译时与含有长5’-UTR的Weak mRNA竞争中处于优势，所以细胞功能得以维持;然而，在eIF4E过度表达的情况下，这些正常情况下不被翻译的含长5’-UTR mRNA的基因产物上调。这些基因产物中包括一些原癌基因及一些重要的细胞生长调节因子，如c-myc、c-fos、p23、VEGF、bFGF等 ［2］ 。上述所提到的基因产物对细胞恶性转化和分裂有重要影响，因此，在多种恶性肿瘤中可检测到eIF4E水平增高 ［3］ 。肿瘤的生长及转移与血管的生成密切相关，而VEGF是目前所知的作用较强的促血管生长因子，其在肿瘤血管形成中起重要作用 ［4，5］ 。故推测VEGF与喉鳞癌的发生、发展及转移相关。本研究采用Western-blot法检测eIF4E、VEGF及bFGF在喉鳞癌中的表达，以探讨其在喉鳞癌的发生、发展及转移中的作用，并分析二者的相互关系，以便为喉鳞癌的早期诊断、有效治疗及判断预后提供重要的科学依据。
1 材料与方法
1.1 标本选取 Western-blot法的标本取自2000年1月～2002年5月间山西医科大学第一医院耳鼻喉科的20例手术切除的新鲜喉鳞癌标本，分别取自喉鳞癌组织的癌中心区（TC）、过渡区（TR）（介于癌组织与病理证实的无癌切缘之间）及无癌区（TF）（病理证实的无癌切缘以外），同时，选取10例全喉切除术的离癌组织较远的正常粘膜，即刻于-80℃冰箱保存备用。
1.2 主要试剂 兔抗VEGF购自Santa cruz公司，鼠抗eIF4E单克隆抗体购自Sigma-aldrich公司，二者的工作浓度均为1:50;羊抗兔及鼠碱性磷酸酶标记的IgG、低分子量蛋白质标志、硝酸纤维素膜均购于华美生物工程公司。
1.3 Western-blot法 选取20例新鲜喉鳞癌标本的癌中心区（TC，tumor core）、过渡区（TR，transtion core）及病理证实的无癌区（TF，“tumor-free”core），各取50mg组织，用组织小剪将其充分剪碎，溶于预冷至0℃的1.0ml的组织蛋白质提取液（50mMTris，150mMNaCl，1%NP-40，100μg/ml PMSF，0.5%脱氧胆酸盐，0.02%叠氮钠，1μg/ml抑肽酶）。超声破碎仪充分破碎细胞，于4℃以11000rpm离心1min，然后于4℃以3000rpm离心10min。12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加入适当稀释的一抗、二抗，BCIP/NBT（即用型）显色，Syngene凝胶成像系统拍摄记录并分析结果。
1.4 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件行单因素方差分析及Spearman相关检验分析结果，检验水准:α=0.05（双侧）。
2 结果
2.1 eIF4E及VEGF在喉鳞癌不同区域的表达 eIF4E在癌组织、过渡区及无癌区的表达分别是正常粘膜组织中表达的15.49±7.98倍、4.64±4.27倍、0.9±0.39倍，喉癌组与过渡区及无癌区、过渡区与无癌区的存在差异有显著性（P<0.05）;VEGF在癌中心区、过渡区及无癌区中的表达分别是在正常粘膜中表达的4.80±1.84倍（2.2～8.3）、1.63±1.89倍（0.6～4.3）、0.97±0.33倍（0.1～1.8），癌中心区与过渡区、无癌区差异具有显著性（P<0.05），而过渡区与无癌区之间差异无显著性（P>0.05）。见表1，图1、2。
表1 eIF4E及VEGF在喉鳞癌不同区域表达 （ˉx±s，n=20）
2.2 eIF4E与VEGF在喉鳞癌组织中表达的相关性 eIF4E与VEGF之间的相关系数为0.971，经查表，eIF4E与VEGF之间存在相关性（见表2）。
表2 eIF4E与VEGF在喉鳞癌组织中表达的相关性 （n=20）
3 讨论
3.1 癌基因eIF4E与喉鳞癌的关系 恶性肿瘤的发生及发展是一个多步骤的过程，是多种基因型及其表型变化的结果，这是由于原癌基因的激活和抑癌基因的失活而引起细胞生长和功能调节的变化，从而致恶性肿瘤的发生及发展。
真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）在蛋白质合成的起始阶段起重要的调控作用。其在正常情况下是低表达，使肩负有“看家”功能的大多数拥有短5’-非翻译区（5’-UTR）的Strong mRNA得以翻译，从而维持细胞的正常功能;当eIF4E过度表达时，就会使具有长5’UTR的“Weak mRˉNA”基因产物上调，从而致肿瘤的发生及发展 ［1］ 。
近几年来，体内外研究发现，eIF4E过度表达与恶性肿瘤的发生及发展有关。在体外实验中，通过eIF4E过度表达的病毒载体转染NIH3T3 ［6］ 、仓鼠卵巢的培养细胞（CHO） ［7］ 及克隆鼠胚胎成纤维组织细胞（CREF） ［8］ 等细胞株，导致了恶性表型;相反，采用反义低聚核苷酸抑制eIF4E过度表达的CREF获得了恶性表型逆转的结果 ［8］ 。另外，Kerekatte等 ［9］ 首先在人乳腺癌中发现eIF4E的过度表达，却不存在于乳房的良性组织中;Li ［10］ 等研究得出，具有eIF4E高表达（≥7倍）的乳癌患者比低表达者（<7倍）具有更差的临床结果;Li ［11］ 等也研究得出乳癌Ⅰ～Ⅲ期的患者中eIF4E高表达者会有更高的癌复发率、癌致死率，其过度表达可能对Ⅰ～Ⅲ期乳癌患者预后具有重要的参考价值;在结肠癌组织中也有eIF4E的过度表达 ［12］ 。Menezes等 ［13］ 于1996年始报道了eIF4E在头颈鳞状细胞癌中的过度表达，而相似部位的良性病变及正常组织无eIF4E过度表达.
本研究采用Western-blot法对20例新鲜喉癌标本的癌中心区、过渡区、组织上的无癌区及10例全喉病人的距离癌组织较远的正常粘膜进行对eIF4E的表达水平检测，在癌中心区、过渡区及无癌区与正常粘膜中eIF4E的表达水平相比较所得倍数作为其表达水平，从统计学分析可以看出eIF4E基因蛋白在无癌区、过渡区及癌中心区中的表达水平是递增的，这样，可以得出:eIF4E的过度表达与喉癌的发生及发展相关，其过度表达或许可以作为喉癌恶性程度的一个分子标志。
Nathan等报道 ［14］ ，eIF4E的增高与头颈肿瘤的恶性进展密切相关，且随着eIF4E水平的增高，其恶性程度也