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【摘要】 目的 观察生血宁治疗失血性贫血的药效及对铁代谢平衡调节的基因机制。方法 将大鼠随机分成正常对照组、失血模型对照组、琥珀酸亚铁对照组100mg/（kg·d）、生血宁治疗组100mg/（kg·d），每组10只。除正常对照组外，其它3组每天尾端放血2ml，连续6天，使造成失血性贫血模型。第6天开始灌药或水。第6、16、24天取血测血常规，第24天取十二指肠标本用RT-PCR法测铁代谢相关基因DMT-1、IREG1、Hephaestin的mRNA表达量。结果 生血宁能提高红细胞计数、血红蛋白、红细胞比积、红细胞平均血红蛋白浓度、缩小红细胞体积分布宽度。生血宁在基因水平能改善铁代谢，降低失血性贫血大鼠铁代谢相关基因DMT-1、IREG1、ephaestin的表达，疗效与琥珀酸亚铁相似。结论 生血宁治疗失血性贫血效果明显;在基因水平能改善铁代谢，降低DMT-1、IREG1、Hephaestin。
关键词 叶绿素盐 失血性贫血 铁代谢 阳离子转运蛋白 基因表达调节
An experimental study on Sheng Xuening treating hemorrhagic anemia and imp
roving iron metabolism
Ke Youfu，Wei Kemin，Zheng Junxian，et al.
Zhejiang Institute of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou310012.
【Abstract】 Objective To observe the efficacy of Sheng Xuening on treating hemorrhagic anemia and its gene mechanism of regulating iron metabolism.Methods 40rats were randomly divided into normal control group，hemorˉrhagic anemia model control group，ferrous succinate control group100mg/（kg·d）and Sheng Xuening treatment group100mg/（kg·d）.The other three groups except normal control group got blood bled2milliliters a day for6days conˉsecutively to make anemia model.Drug or water was given everyday by oral gavage respectively beginning at the sixth day.Blood routine examination was measured at the sixth，sixteenth and twenty-fourth day，RT-PCR was used to measure the expression of DMT-1，IREG1and Hephaestin mRNA in duodenum at the twenty-fourth day.Results Sheng xuening can increase red-cell count，haemoglobin，hemotocrit and mean corpuscular hemoglobin concentraˉtion;and narrow red cell distribution width.Sheng Xuening can improve iron metabolism at gene level，lowering exˉpression of DMT-1、IREG1、Hephaestin mRNA in hemorrhagic anemia rats.It’s effect is similar to ferrous succinate.Concl
usion Sheng Xuening has significant effects on treating hemorrhagic anemia.It can improve iron metabolism at gene level，lowering DMT-1，IREG1and Hephaestin.
Key words chlorophyllides hemorrhagic anemia iron metabolism cation transport proteins gene expresˉsion regulation
生血宁是将蚕砂经丙酮浸提糊状叶绿素，再将叶绿素结构中的镁离子皂化、铁代、络合成铁叶绿酸钠，其结构与血卟啉极其相似，是一种有机卟啉铁，能直接被肠粘膜细胞吸收，2000年批准成为中药Ⅱ类新药。生血宁临床治疗缺铁性贫血已有报道 ［1，2］ 。为进一步观察生血宁治疗失血性贫血的疗效及改善铁代谢相关基因的机制，近期作了更深一步的实验研究。
1 材料与方法
1.1 动物和材料 Sprague-Dawley大鼠40只，雌雄各20只，体重160～200g，由浙江省中医药研究院动物实验室提供，实验动物室是SPF级和清洁级。紫外可见分光光度计（瓦里埃ary100），PCR仪（美国Bio-metra公司），DEPC（美国Fluka公司），凝胶成像扫描分析系统（英国SynGene公司的GeneGenius），总RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒（美国Promega公司）。RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司），琼脂糖、100bp DNA ladder Marker、5×TBE、溴化乙锭等购自上海生工公司。四对引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。琥珀酸亚铁用金陵药业股份有限公司的速力菲。
1.2 分组 每组10只大鼠，雌雄各半，随机分为4组。（1）正常对照组（灌等体积水），（2）失血模型对照组（灌等体积水），（3）琥珀酸亚铁对照组（100mg/kg），（4）生血宁治疗组（100mg/kg）。
1.3 造模与给药 除正常对照组外，其它3组于第1～6天每天尾端放血2ml，使造成失血性
贫血模型。第6天开始灌药或水。
1.4 一般指标检测 于第6天、第16天分别尾端取血、第24天摘眼球取血测定血常规;第16天、第24天测外周血网织红细胞计数。
1.5 总RNA的提取 第24天处死大鼠，取十二指肠，在RPMI—1640培养液中漂洗去食糜，放入液氮中保存。应用Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation system试剂盒提取总RNA。每份50mg十二指肠标本加入0.6ml的变性液中，匀浆器中匀浆。加2M醋酸钠60μl混匀，加0.6ml苯酚-氯仿-异戊醇后振荡，放置冰上15min。4℃，10000g离心20min。移水相后用异丙醇在-20℃沉淀RNA至少5min;4℃，10000×g离心10min;75%冰乙醇1ml洗1次，4℃，10000g离心10min;空干后用适量无核酶水溶解，在紫外可见分光光度计上测OD260/OD280的比值及浓度，比值>1.7，调成适当浓度（约1μg/μl）后-20℃保存。
1.6 合成引物 大鼠DMT-1mRNA（GenBank accession number AF008439）;大鼠IREG1mRNA（GenBank accession number AF394785）;大鼠Hephaestin mRNA（GenBank accession number AF246120）。据此设计DMT-1引物F:5’CCTCg gTˉgCC ATCAA CCCTg CT3’，R:5’ACgAT gCCCA CCgCC TgCT3’，产物173-883，cDNA产物710bp，基因组产物7k左右。IREG1引物F:5’TTCgg ACTgg TCTgT TCTC3’，R:5’ATAAg ATgTC CCATT gCCAC A3’，产物1345-1843，cDNA产物498bp，基因组产物1.6k左右。hephaestin引物F:5’ggAgT ATTCC AgAAg gTCAT g3’，R:5’TgTCC ACggA TACTC AgTg3’，产物575-1034，cDNA产物459bp，基因组产物2.2k。根据已有报道合成SD大鼠β-actin寡核苷酸引物，上游5’-Tgg AAT CCT gTg gCA TCC ATg AAA C-3’，下游5’-TAA AAC gCA gCT CAg TAA CAg TCC g-3’，该引物可扩增出长 度346bp的β-actin cDNA片段。
1.7 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 应用Promega公司的AccessQuick RT-PCR单管反应液系统。系统将Tfl DNA Polymerase、magnesium chloride和reaction buffer等放在一个管中，AMV反转录酶放在另一个管中。只要将AcˉcessQuick反应液加入有RNA模板的反应管中，再加入AMV反转录酶和引物即可完成。反应总体积为50μl，模板RNA及上下游引物各2μl，反应条件为46℃下45min进行1个循环，94℃下2min进行1个循环，94℃下变性30s、55℃下退火1min、68℃下延伸1min，进行35个循环，再68℃下延伸7min。以上操作于PCR扩增仪中进行。
1.8 PCR产物的分析及定量 取PCR产物5μl及1μl的6×上样缓冲液混合后加于2%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml的溴化乙锭染色）中电泳，电压120V，时间40min。用凝胶成像分析系统扫描凝胶，以β-actin基因片段为内标准，用GeneTools软件获得待测基因条带与β-Actin条带各自峰面积的比值。
1.9 统计方法 全部数据采用SPSS11.0统计软件处理。
2 结果
2.1 生血宁对失血性贫血大鼠血液系统影响 大鼠失血性贫血模型造模结束时红细胞平均减少49.8%，血红蛋白平均减少40.1%，贫血明显。经过10天的治疗，红细胞系基本接近正常，外周血网织红细胞已较模型对照组明显下降。经18天治疗实验结束时，红细胞系更进一步恢复，网织红细胞与正常无异，见表1～4。
表1 失血性贫血大鼠造模后各组红细胞指标的比较 （略）注:各组与正常对照组比较， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01;琥珀酸亚铁对照组及生血宁治疗组与模型对照组比较， △ P<0.05， △△ P<0.01;下同。
表2 生血宁治疗失血性贫血大鼠10天后各组红细胞指标的比较 （略）
表3 生血宁治疗失血性贫血大鼠18天后各组红细胞指标的比较 （略）
表4 生血宁失血性贫血大鼠外周血网织红细胞的影响 （略）
2.2 生血宁对失血性贫血大鼠铁代谢相关基因表达的影响 贫血模型DMT-1、IREG1、ephaestin基因表达增强，治疗后表达恢复正常，生血宁抗贫血效价同琥珀酸亚铁相同。见表5。
表5 生血宁对失血性贫血大鼠铁代谢相关基因表达的影响 （略）
3 分析与讨论
近年来，在小肠粘膜细胞相继发现了DMT-1（divalent metal transporter1） ［3，4］ 、Dcytb（duodenal cytochrome b） ［5］ 、IREG1（iron regulated gene1） ［6］ 和Hephaestin ［7］ 等4种与铁转运相关的蛋白质。这些蛋白的发现是铁代谢领域中近年取得的最大突破，也使小肠如何吸收铁这一重要问题有了基本答案，人类对铁吸收、平衡、代谢机制的认识较前有了质的飞跃。研究证实，铁的粘膜吸收过程是由Dcytb和DMT-1合力完成的。Dcytb将肠腔内Fe 3+ 还原成Fe 2+ ，肠道Fe 2+ 依赖DMT-1进入十二指肠细胞。而IREG1和Hepˉhaestin则参与从肠上皮细胞的基底侧将铁转运入血液循环。IREG1将肠细胞内铁转运至血液，而Hephaestin将Fe 2+ 氧化成Fe 3+ ，协助IREG1转运铁入血循环。缺铁性贫血时，铁代谢相关基因及蛋白表达改变以求恢复铁平衡。DMT-1、Dcytb、IREG1、Hephaestin、转铁蛋白、转铁蛋白受体基因表达增加，相应蛋白增多，而铁蛋白则下降 ［8～10］ 。基因与蛋白改变的程度总是与铁缺乏的程度相平行的。不同的铁剂影响铁平衡调节基因表达的程度是不同的，从而能反映出不同制剂的抗贫血效价。 生血宁是由浙江省中医药研究院研制的科技成果，转让给武汉红桃K集团股份有限公司生产，国家药品监督局批准上市的新药（批准文号:Z20000081），其主要成分是蚕砂提取物———铁叶绿酸钠（批准文号:Z20000080），主治缺铁性贫血，机制独特，Ⅱ期临床试验有效率为91.43%，无明显不良反应 ［2］ 。
短期大量失血或长期慢性失血或喂食低铁饲料终将发展成缺铁性贫血。本研究中大鼠失血性贫血模型造模结束时红细胞平均减少49.8%，血红蛋白平均减少40.1%，贫血明显，说明通过6天的短期大量放血造模是成功的，如果控制饲料中的铁含量定将造出缺铁性贫血模型。根据前的生血宁的药效学研究，认为没有必要喂食低铁饲料 ［11］ 。生血宁改善失血性贫血大鼠贫血指标明显，能提高红细胞计数、血红蛋白、红细胞比积、红细胞平均血红蛋白浓度、缩小红细胞体积分布宽度。生血宁治疗失血性贫血大鼠的效果与临床治疗缺铁性贫血的效果是相似的。 生血宁可以不通过DMT-1而直接进入十二指肠细胞，但IREG1、Hephaestin对生血宁中的铁转入血循环的快 慢是有影响的。由于国际上尚无试剂盒可以测定十二指肠中DMT-1、IREG1、phaestin蛋白的表达量，且从人体取十二指肠标本很难，所以我们结合失血性贫血大鼠的实验研究以探讨生血宁对DMT-1、IREG1、Hephaestin mRNA表达的影响。缺铁性贫血时DMT-1、IREG1、Hephaestin基因表达增加，生血宁治疗后铁代谢相关基因DMT-1、IREG1、Hephaestin表达恢复正常，与模型对照组相比差异有非常显著性，说明生血宁在基因水平能改善铁代谢。
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（收稿日期:2004-05-17） （编辑海 天）
基金项目:浙江省医药卫生科学研究基金资助项目（项目编号:2003B023）
作者单位:310012浙江大学医学院
310007浙江省中医药研究院