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【摘要】 目的 本实验通过不同剂量益气化瘀汤对实验性心肌梗死大鼠的治疗，以观察缺血区血管新生情况，并初步探讨其机制。方法 给实验室心肌梗死Wistar大鼠分别灌服生理盐水，大、中、小剂量的益气化瘀汤，6周后处死大鼠取心腔血，留心脏标本，10%福尔马林固定。对比观察心肌梗死大鼠梗死面积、左室梗死边缘区血管内皮细胞生长因子（VEGF）含量，梗塞边缘区血管密度、血液中CD34细胞含量的影响。结果 益气化瘀汤具有:（1）显著减少心肌梗死的面积。大、中剂量组与对照组相比，有统计学意义（P<0.01）。（2）能增加梗死边缘区血管的密度。大、中剂量组与对照组相比，有统计学意义（P<0.01）。（3）能增加梗死区VEGF的含量。大、中剂量组与对照组相比，有统计学意义（P<0.01）。（4）能增加血液中CD34细胞的含量，大、中剂量组与对照组相比，有统计学意义（P<0.01）结论 益气化瘀汤对实验性心肌梗死大鼠有:（1）较好的促血管新生的作用，能显著的减少心肌梗死面积，增加梗死边缘区血管密度;（2）其作用机制与其能动员骨髓中干细胞到血液中和增加缺血区局部VEGF的产生有关。
关键词 益气化瘀汤 血管新生 CD34细胞 血管内皮细胞生长因子
The effect of promoting angiogenesis on experimental miocardial infarction rat by Yiqihuayu Decoction
Gao Tiexiang，Chen Jing
Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan，Hubei430061.
【Abstract】 Objective To observe the effect of promoting angiogenesis on experimental miocardial infarction rat by Yiqihuayu Decoctionwith different dose and discuss the action mechanism.Methods Experimental miocardial infarction wistar rat are taken orally with physiological saline，high-dose，middle-dose and small-dose Yiqihuayu Decoction，taking the blood from heart after6weeks，keeping heart as sample fixed by10%formalin.Then observe the infarction area，the content of VEGF，blood vessel density，and the CD34content with the conrol group.Results The effect on the experimental miocardial infacton rat by Yiqihuayu Decoction are as follows:（1）It can reduce the inˉfarction area.High-dose，middle-dose and the control group have obvious difference（P<0.01）.（2）It can increase the blood vessel density in the infarction verge.High-dose，middle-dose and the control group have obvious differˉence（P<0.01）.（3）It can increase the content of VEGF in the infarction section.High-dose，middle-dose and the control group have obvious difference（P<0.01）.（4）It can increase the CD34content in the blood.High-dose，midˉdle-dose and the control group have obvious difference（P<0.01）.Conclusion Yiqihuayu Decoction has better efˉfect on promoting angiogenesis.It can obviously reduce the infarction area，increase the blood vessel density in the inˉfarction verge.What’s more，the action mechanism is related with its effect on promoting CD34cell from marrow to blood and increasing the content of VEGF in the infarction section.
Key words Yiqihuayu Decoction angiogenesis CD34cell VEGF
中医药治疗冠心病有着悠久的历史，一些方药至今仍广泛应用于临床，其疗效较好。以往中医药治疗冠心病主要集中在活血化瘀、芳香温通，理气解瘀，益气养阴，化痰逐瘀，补肾固本等方面，但如何促进心肌缺血区的血管新生报道甚少。由黄芪、丹参、当归、赤芍、大黄、水蛭等组成的益气化瘀汤对此具有较好的疗效。本实验对其药效学进行了实验研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 清洁级Wistar大鼠120只，雌雄各半，体重（200±20）g，购自华中科技大学同济医学院。
1.1.2 药物与试剂 血管内皮细胞生长因子兔源性多克隆抗体、第Ⅷ因子鼠源性多克隆抗体，购于晶美公司。CD34鼠源性多克隆抗体，购于天源公司。
1.1.3 仪器 Olymplus显微镜、HPIAS2000图像分析仪。
1.2 方法
1.2.1 大鼠心肌梗死的模型制备 取健康清洁级Wistar大鼠，体重（200±20）g，雌雄不拘。20%乌拉坦5mg/kg腹腔注射麻醉。无菌条件下，切口前缘起自胸骨缘，开胸，剪开心包，暴露心脏。在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处用5-0丝线结扎冠状动脉前降支近端。心脏放回胸腔，迅速逐层缝合心包、胸壁。术后注射青霉素和链霉素预防感染。
1.2.2 分组及给药 将模型大鼠随机分成4组。即益气化瘀汤1.5g/ml组、益气化瘀汤0.75mg/ml组、益气化瘀汤0.375mg/ml组、对照组。每天1次，共6周。
1.2.3 取标本 6周后，大鼠断头处死。开胸取心脏血2ml，取出心脏，0.1M PBS洗涤，滤纸吸干后浸泡于10%福尔马林中固定。取结扎以下部分，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。检测相关指标时连续切片。
1.2.4 检测指标 （1）梗死面积的测定:固定后的心脏经石蜡包埋切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察心肌坏死情况。用HPIAS2000图像分析仪检测心肌梗死面积和左室面积比，梗死面积（%）=心肌梗死面积/左室面积×100%表示。（2）梗死边缘区血管密度测定:心肌细胞组织第Ⅷ因子免疫组化染色后的切片，经HPIAS2000图像分析仪分析系统处理，测量左室梗死边缘区显示的第Ⅷ因子阳性血管的数目。（3）左室梗死边缘区VEGF的含量测定:对梗死边缘区心肌组织免疫组化切片染色，在HPIAS2000图像分析仪分析系统中用免疫组化定量软件进行VEGF的含量测定。（4）血液中CD34细胞的测定:将采集的血液与CD34-PE荧光单克隆抗体室温暗处反应15min，然后用细胞裂解液裂解红细胞，用流式细胞仪检测CD34单个核细胞的百分率，用CD34细胞/单个核细胞×100%表示。
1.2.5 统计学处理 所有检测结果用ˉx±s表示，采用SPSS10.0统计软件对各组间的差异进行方差分析，Q检验。
2 结果
2.1 益气化瘀汤对心肌梗死面积、梗死区血管密度的影响 与对照组相比有统计学意义（P<0.01）。见表1，2。
2.2 益气化瘀汤对梗死边缘区的VEGF含量、血液中CD34细胞的影响 与对照组相比有统计学意义（P<0.01）。见表3，4。
表1 益气化瘀汤对心肌梗死面积的影响 （略）
注:与对照组相比， Δ P<0.01， ˇ P>0.05
表2 益气化瘀汤对梗死边缘区血管密度的影响 （略）
注:与对照组相比， Δ P<0.01， ˇ P>0.05
表3 益气化瘀汤对梗死边缘区VEGF 的含量的影响 （略）
注:与对照组相比， Δ P<0.01， ˇ P>0.05
表4 益气化瘀汤对血液中CD34细胞的影响 （略）
注:与对照组相比， Δ P<0.01
3 讨论
祛瘀生新是一个古老的中医理论，它源于阴阳学说，其萌芽可追溯至秦汉时代，在《内经》中就常常体现出祛瘀生新的思想。如《素问·离合真邪论》有云:“疾出以攻盛血，而复其真气”，这就是在强调通过祛瘀“恶血”来扶持正气。祛瘀生新不论是理论、还是论治都在明清得到了长足的发展。祛瘀生新的理论核心是“瘀血不去，新血不生”。但是，很多人在临床上只注意了祛瘀而忽视了生新或者认为生新就是生新血。结果使祛瘀生新往往徒有其表而名不符实，变成了单纯“活血化瘀”或者是“活血化瘀”加上“养血”法。这是对祛瘀生新理论精髓的理解不足所造成的。因此，精确地把握祛瘀生新的关系，生新包括了哪些内容，对于我们理解和应用祛瘀和生新法是至关重要的。
治疗性血管生成是指应用药物、基因治疗或其他治疗手段增加侧支动脉的生成来治疗血管狭窄引起的缺血，主要用于缺血性的疾病的治疗，如冠状动脉硬化引起的心肌缺血、闭塞性脉管炎和糖尿病引起的肢体缺血、褥疮、器官移植及慢性溃疡等。
促血管新生的因素很多，目前认为下列因素可刺激血管新生:（1）缺血与缺氧研究表明:心肌缺血、缺氧时，缺血心脏中VEGF ［1］ 、成纤维细胞生长因子等细胞生长因子及其受体增加而促血管新生;（2）炎症作用炎症时巨噬细胞和中性粒细胞通过释放某些促血管生成样物质而刺激血管新生 ［2］ ;（3）其他，如:一些药物、机械刺激、激光、一氧化氮等均能促进血管新生。
在治疗上，已经开展了外源性VEGF及其基因治疗缺血性疾病并在动物实验及临床治疗中取得了肯定的结果。药物内源性促进VEGF产生的报道较少。到了现代，中医对胸痹的心痛有了较全面的认识，认为其病变在心，与肝、脾、肾关系密切，其发生与年老体衰，七情内伤，饮食失节等因素有关。病机包括两方面，以心、脾、肾阳气亏为本，久病则气阴或阴阳两虚，以血瘀、气滞、痰浊为标，针对其病机而补其不足，泄其有余，对于急性发作期多以标实为主，相应的采取活血理气，温通化痰，缓解期以本虚为主，相应的补各脏之不足。
由黄芪、丹参、当归、赤芍、大黄、水蛭组成的益气化瘀汤。以黄芪之甘温大补之气，扶助心气，是为君药;丹参、赤芍活血化瘀，通行血脉，当归补血活血，三药均为臣药;佐以大黄酒制后取其活血化瘀之力，合水蛭破血逐瘀。综观本方，集补气、养血、活血、逐瘀于一身，扶正之中兼有祛邪，甘温之中又兼寒凉，全方共奏补养心气，活血祛瘀之功。治疗性血管新生是目前治疗冠心病最受瞩目的理论和方法，代表冠心病治疗的方向，是近年来冠心病治疗的研究热点。从血管新生机制来研究中医基础理论及中药作用机制的工作才刚起步，我们要应用分子生物技术，科学的研究相关的单味中药或方药的药理作用和机制，这对于阐明中医的理论，中药的药理作用及开发新药具有重大的意义。
参考文献
1 Hashimoto E，Ogita T，Nakaika T，et al.Rapid induction of vascular enˉdothelial growth factor expression by transient ischemia in rat heart.Am J Physiol，1994，267（5Pt2）:1948-1954.
2 Schaper W，Ito WD.Molencular mechanisms of coronary collateral vessel growth.Circ Res，1996，79（5）:911-919.
（收稿日期:2004-08-07）
作者单位:430061湖北中医学院
（编辑晓 亮）