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【摘要】 目的 利用PyrosequncingTechnology（PSQ）进行核酸突变位点的检测。方法 它通过磁珠与PCR引物结合，使得PCR单链产物一步合成并伴随发光反应，计算机通过对发光峰值的分析，实现对DNA序列的测定。结果 通过计算机将实验结果和理论预测值进行对比，可以自动的计算出等位基因出现的可能未知型别。结论 PSQ技术对基因组碱基频率分析的分辨率可以达到5%左右，必将在更广泛的领域得到应用。
关键词 多通道测序技术 核酸 检测
Application of Pyrosequencing technology in nucleic sequencing
Zhang Long，Ma Hongtao，Cheng Shaohui
Faculty of Biosciences and Bioengineering，Beijing Industrial University，Beijin.100022.
【Abstract】 Objective To assay nucleic acid mutation site and sequence with Pyrosequening technology（PSQ）.Methods By combining magnetic heads and PCR primer，it makes DNA products synthesized in one step aˉlong with radiation reaction.Computer can analyse radiation ultimate data and get the sequence of DNA products.Reˉsults Comparing the experiment results and predicted results with the computer，the possible nucleic acid can be count out.Conclusion The ratio of PSQ technology distinguishing gene PCR products can attain5%，it will be wideˉly applied in research fields by all means.
Key words pyrosequencing technology nucleic acid assay
Pyrosequencing Technology（PSQ）即多通道测序技术是美国Biotage公司研制的一项高通量核酸检测系统，该系统包括一套检测仪器和相应的试剂盒。目前北京工业大学生命科学与生物工程学院与杭州陆博科技有限公司合作在国内首次引进了该项技术和相应的检测系统。为了更好地开发和推广这项研究于科研工作和对外服务，特撰写此文简介工作原理和应用现况。
1 工作原理及程序
1.1 工作原理 PSQ技术采用PCR技术结合测序技术两部分完成，与常规方法不同的是对于单链的分离策略采用的是生物素化标记的PCR单链引物，通过磁珠与生物素化的PCR引物结合，采用96磁力分离板实现了在普通96孔塑料板上生物素化PCR单链产物的一步分离，序列测定在策略上采用DNA合成伴随发光反应，计算机程序对发光峰值的高低分析，完成对DNA合成序列的判定。在这个过程中，Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶）为核酸降解酶，可以持续地降解没有被掺入的多余的碱基，保障了发光反应的信号与掺入碱基的可参比性，实现了测序分析的定量和定性。工作原理（见图1）。
1.2 工作程序
1.2.1 测序引物与单链DNA杂交 将磁珠分离后的PCR单链产物或者DNA模板与DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，虫荧光素，三磷酸腺苷双磷酸酶，感光底物，APS等反应物质共孵育。
1.2.2 DNA单链序列合成 首先4种三磷酸核苷酸加到反应体系中，在测序引物的引导下，在DNA聚合酶作用下催化脱氧三磷酸腺苷掺入DNA单链中，每个掺入反应焦磷酸盐的释放，反应伴随着等摩尔的PPi的释放，见反应式1。（DNA） n +dNTP Polymerase （DNA） （n+1） +ppi
1.3 DNA合成伴随发光反应的形成 APS与PPi在硫酸化酶的作用下，合成ATP。在ATP的能量提供下，荧光素酶催化虫荧光素为氧合荧光素，产生的可见光等同于ATP的消耗量，相应地每个光波等同于掺入的核酸数目;催化反应产生的光可以被CCD摄像头收集，反应在计算机程序上为可见的峰值，每个峰与一个掺入的核苷酸数目相同（见图2）。
1.4 DNA合成和发光反应的延续 Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶）为核酸降解酶，可以持续地降解没有被掺入的多余的碱基，当降解过程完成后，另一个dNTP加入于反应体系中，进行下一个DNA碱基的合成，见式2、式3: 式2: dNTP Apyrase dNDP+dNMP+phosphate 式3: ATP Apyrase ADP+AMP+phosphate
1.5 结果分析 随着步骤进行，同时dNTP碱基不断加入，DNA互补链的合成以及核苷酸序列的产生可以从发光信号产生的峰值来决定。应该指出的是实验中作为原料产生使用的是用α-硫化的三磷酸腺苷（dATPαS），用它来代替三磷酸腺苷（dATP），因为它可以有效地被DNA聚合酶利用，而不被虫荧光素识别（见图3）。
图1 PSQ工作原理（略）
图2 DNA合成伴随发光反应（略）
图3 发光信号（略）
2 应用领域现况
一种技术的改进将很大地推动相应研究的发展，随着PSQ高通量测序技术的问世，生物学家在高通量测序分析、等位基因的研究和分析、突变位点的筛查等很多领域内开展了一系列研究，相应的文献报道屡见不鲜 ［1］ 。现将主要的研究领域工作作一简要论述。
2.1 应用PSQ分析系统进行测序分析 应用PSQ96孔分析系统，采用测序分析软件与试剂盒可以轻松地完成20～40个碱基的测序工作，在1h内轻松完成96个样品的测序工作。通过计算机软件将发光信号识别为A、G、C、T的碱基排列信号，对于一些序列位置的片断可以以已知的序列或者保守区的序列作为测序序列来完成未知序列的分析; 这对于一个实验来说减少了连接转化的繁琐，在PCR扩增的过程中，可以使用其中一条引物作为测序引物来完成对未知序列的检测，使工作更简单而富有成效。在测序过程前，采用SSB（single-stranded DNA-Binding protein）消除DNA二级结构，可以增加合成的效率和扩增序列的长度 ［2］ 。经实验证实采用PSQ系统至少可以精确完成30个碱基的测序工作，经过Blast同源序列对比，发现30个碱基同源性100%的概率几乎是唯一的，所以有理由认为通过测序分析可以确定未知的DNA序列，见图4。
图4 发光信号的峰值图谱，可以通过计算机将峰值的信号转化为碱基测序结果（略）
2.2 研究等位基因的序列和分析方法 PSQ是建立在简单快速的SNP位点和突变点的分析基础上而不需要进行染胶特殊的标记和费时的工作，应用SNQ软件可以事先预测出可能的基因型别，并展示出理论预测的基因型别的可能组合，通过计算机将实验结果和理论预测值进行比对，可以自动的计算出等位基因出现的可能未知型别（见图5） ［3］ 。
图5 计算机自动计算等位基因的可能未知型别（略）
从图5可以看到实验测序结果（峰纹图）与预测结果（长方图）位置吻合，证明了测序结果与所预测的一种基因型别组合完全相同，预测正确的检测孔在96孔板中用黄色标志表示。
2.3 碱基频率分析的检测 对于基因出现频率的分析 ［4］ ，也可以通过PSQ得到很好的解决，尤其对于基因组序列的分析，只需要作1次PCR和1次测序反应即可完成某段等位基因的碱基出现频率的准确的检测。掺入碱基的数目和发光信号的高低提供了碱基出现频率的信息，对于基因组PCR产物的碱基频率分析，PSQ的分辨率可以达到5%左右，这种高检测能力尤其适用于有多个细胞、多种组织基因型别的肿瘤组织（见图6）。
图6 计算机碱基频率分析的检测
由图6可以看到A出现的频率为70%，T出现的频率为30%。
3 应用前景展望
在人类基因组计划图谱绘制完成后，进入功能基因组时代研究，人类基因组研究在技术上最突出的特点是:高通量、大规模。针对基因组测序、医学基因组学研究、基因表达调控研究和人类疾病的动物模型的建立等主要研究领域，均需建立相应的符合上述技术特点的技术方法平台。当理论研究深入到一定程度后，往往“技术发展”成为“瓶颈”和继续发展的关键条件。因此，技术发展在人类基因组研究中始终是科学家和决策者重点考虑的一个方面。它包括DNA测序新技术、生物信息高效分析方法、高通量SNP 检测技术、突变检测新技术、cDNA微阵列和基因芯片技术、微阵列和基因芯片技术、质谱新技术等。
其中Pyrosequencing Technology在核酸序列研究中有无可比拟地优势，相比芯片技术而言，有更好的操作性，可以灵活地改变所要研究实验方案和测序分析结果。而且不需要更多的设备，实验准备阶段简单，只需要合成相应的引物即可，实验耗材便宜且使用方便。
应用Pyrosequencing Technology可以结合不同研究机构和医院自己的研究课题方向开展卓有成效的科研工作，目前北京工业大学生命科学与生物工程学院在已有的工作基础上开展SARS毒株SNP的研究，并找到了含有突变的SNP位点，正在开展HIV药物治疗后耐药基因类型的研究。
参考文献
1 Mostafa Ronaghi，Elahe Elahi.Pyrosequencing for microbial typing.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2002，782（1-2）:67-72.
2 Nordstr⒐m T，Gharizadeh B，Pourmand N，et al.Method enabling fast partial sequencing of cDNA clones.Anal Biochem，2001，292（2）:266-271.
3 Elahii E，Pourmand N，Chaung R，et al.Determination of hepatitis C virus genotype by Pyrosequencing.J Virol Methods，2003，109（2）:171-176.
4 Agaton C，Vnneberg P，Sievertzon M，et al.Gene expression analysis by signature pyrosequencing.Gene，2002，289（1-2）:31-39.
（收稿日期:2004-07-16）
作者单位:100022北京工业大学生命科学与生物工程学院
（编辑日 强）