肝毒清颗粒对酒精性肝损伤大鼠内毒素血症的保护作用

 　【摘要】 目的 本实验旨在验证肝毒清颗粒对酒精性肝病合并内毒素血症的保护作用。方法 采用SD大鼠进行酒精灌胃制作酒精性肝损伤动物模型，观察肝毒清颗粒对酒精性肝损伤大鼠血浆内毒素（ET）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）及肝组织病理学指标的影响。结果 模型组ET、TNF-α及IL-6高于治疗组（P<0.05），明显高于正常对照组（P<0.01）;治疗组与对照组比较，差异无显著性（P>0.05）;所有检测数据同肝组织的病理学变化相一致。结论 肝毒清颗粒有较好的防治酒精性肝损伤合并内毒素血症的作用。

　　关键词 肝毒清颗粒 大鼠 肝损伤 内毒素血症
   
　　The protective effect of Ganduqing granule on alcoholic  liver injury and endotoxemia in rats  
　　Wei Mei，Liu Qiru，Wu Yuchuan，et al.
   
　　Department of lntegrated Traditional and Western Medicine of Luzhou Medical College，Sichuan646000.
   
　　【Abstract】 Objective To observe the protecitve effect of Ganduqing granule on alcoholic liver injury and enˉdotoxemia in rats.Methods The SD rat model of alcoholic liver injury was induced by intragastric infusion of alcohol orally and the levels of plasma endotoxin（ET），tumour necrosis factor alpha（TNF-α）and interleuckin-6（IL-6）were measured and liver pathology was observed with light microscopy.Results The levels of ET，TNF-αand IL-6in the model group were higher than those in the Ganduqing granules group（P<0.05），and were obviously higher than those in the normal control group（P<0.01）.But there was no singificant difference between the Ganduqing granules group and the normal control group（P>0.05）.All of the data were corresponding to the degree of morphoˉlogical changes.Conclusion Ganduqing granule has a better protective and therapeutic effect on alcoholic liver injury and endotoxemia.
   
　　Key words ganduqing granule rats hepatic injury endotoxemia  

　　近年来，大量临床观察与动物实验结果均表明酒精性肝损害患者与动物血中内毒素水平明显升高 ［1］，并且发现酒精性肝病的各种危险因素与内毒素增高有关 ［2］  。本研究用SD大鼠行酒精灌胃制作酒精性肝损伤动物模型，观察肝毒清颗粒对酒精性肝损伤大鼠内毒素血症的保护作用。

　　1 材料与方法
   
　　1.1 实验材料 SD大白鼠36只，雌雄各半，体重180～200g，由泸州医学院实验动物科提供。肝毒清颗粒，由泸州医学院附属中医院制剂室提供，批号为:20020507。酒精选用北京酿酒总厂出品的56°红星二锅头（即:10.2mol/L的酒精溶液），批号:20030526。酶标仪（Bio-Rad450型），上海精密科学仪器有限公司生产。全自动生化仪，华东电子管厂生产。
   
　　1.2 实验方法 36只大鼠随机分成三组，即正常对照组（10只），模型组（14只），肝毒清颗粒组（治疗组12只），自购买之日起，先正常饲养1周。各组动物在实验期间全部均以标准颗粒饲料喂养。模型组:每日早、晚酒精灌胃各1次，酒精用量第1周为8g/（kg·d）;第2周为10g/（kg·d）;第3周为12g/（kg·d）;第4～8周为15g/（kg·d）。治疗组:同样方法酒精灌胃的基础上，每日喂肝毒清颗粒（溶解后灌胃），每次5g/kg。正常对照组:按模型组酒精用量的等比体积用生理盐水灌胃。于第8周末，依次用1%的戊巴比妥（30mg/kg）腹腔内注射，打开腹腔，下腔静脉取血，4℃低温分离血浆，检测ET、ALT、AST、TNF-α及IL-6。取小片肝组织用40g/L甲醛固定，制片，HE染色，行光镜检查，TNF-α、IL-6采用免疫酶联ELISA法检测（试剂盒由深圳晶美生物制品有限公司提供）;ET按上海医化所鲎试剂药盒说明书进行检测。
   
　　1.3 统计学方法 本实验中计量资料以均数±标准差（ˉx±s）表示，两组比较采用t检验，在SPSS10.0软件下进行，P<0.05为差异有显著性。
   
　　2 结果

　　实验过程中模型组有4只大鼠死亡，治疗组有1只大鼠于取标本前2天死亡，正常对照组在整个实验过程中没有大鼠死亡。剔除死亡大鼠，以下结果为31只大鼠情况。

　　2.1 一般情况观察 模型组动物酒精灌胃后，活动明显减少，早期嗜睡，有时呈麻醉状态，可长达7～8h，食欲逐渐下降，质量增加极缓慢，有的甚至不增加;后期毛色灰黄，错乱不纯，有明显营养不良表现，对声响、捕捉反应迟钝。治疗组早期亦有嗜睡表现，但食欲尚好，质量增加较快，毛发较整洁，有光泽，对声响、捕捉反应良好。正常对照组动物质量增加极快，毛发白纯，食欲好，活动灵活，反应敏捷。
   
　　2.2 肝脏大体所见 正常对照组肝脏表面光滑，呈暗红色、弹性好。模型组肝脏部分肿胀、表面呈灰白色或暗紫色。治疗组肝脏肉眼所见与正常对照组基本相同。
   
　　2.3 肝脏病理组织学所见 正常对照组肝小叶结构完整，肝板排列整齐，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞无变性、坏死，未见淤胆及窦细胞增生，汇管区少许淋巴细胞浸润。模型组肝组织坏死严重，肝小叶结构破坏，肝细胞呈大片坏死，空泡变性，残留少量肝细胞，肝窦扩张，充血、出血明显，汇管区及坏死区可见明显炎性细胞浸润。治疗组肝小叶结构尚完整，肝板排列欠整齐。肝细胞有不同程度的肿胀，少部分呈气球样变，肝小叶内偶见点灶状坏死，窦细胞增生及淤胆不明显，汇管区淋巴细胞浸润。与模型组相比较，治疗组坏死程度较轻微。
   
　　2.4 各组大鼠血生化指标变化情况 见表1、表2、表3。

　　表1 各组大鼠ET含量变化情况 （略）
     
　　注:与正常对照组比较， △ P>0.05， ˇ P<0.01;与治疗组比较， ◇ P<0.01
   
　　表2 各组大鼠TNF-α、IL-6含量变化情况 （略）
     
　　注:与正常对照组比较， △ P>0.05， ˇ P<0.01;与治疗组比较， ◇ P<0.01
   
　　表3 各组大鼠ALT、AST含量变化情况 （略）
     
　　注:与正常对照组比较， △ P>0.05， ˇ P<0.01;与治疗组比较， ◇ P<0.01
   
　　3 讨论

　　在欧美国家，酒精性肝病属常见病，多发病，是中青年死亡的主要原因之一。在我国，随着生活条件的改善，酗酒有增多的趋势，酗酒所带来的肝脏损害也趋普遍 ［1］  。因此，正确认识酒精引起的肝损害，及时予以诊断和防治具有重要意义。近年来，大量临床观察和动物实验结果表明酒精性肝损害患者和动物中内毒素水平明显升高 ［2］  ，并且发现酒精性肝病的各种危险因素与内毒素增高有关 ［3］  。此外，细胞因子在酒精性肝病发生发展中所起的重要作用引起越来越多的重视。内毒素血症一但形成以后，既可加重原有肝损害，又可诱发全身代谢和血液动力学紊乱，参与种种并发症的发生和发展 ［4］  。而内毒素对肝脏的损害除了直接作用外，还间接通过细胞因子如TNF-α、IL-6等释放大量细胞毒素来实现。酒精性肝病时，内毒素血症的发生机制可能与下列因素有关:（1）酒精引起肠道菌群紊乱，（2）酒精引起肠黏膜通透性增高，内毒素吸收增多。（3）肝脏对内毒素清除功能减退。（4）酒精对Kupffer细胞的影响。在本实验中模型组同时伴有血清中ALT、AST明显升高，其肝脏出现明显脂肪变性、坏死及炎性细胞浸润等病理学改变。而治疗组上述指标和病理学改变均有所改善，这一方面证实了前述内毒素在酒精性肝病发病机制中的重要作用，另一方面也提示肝毒清颗粒确有降低血浆内毒素的作用。
   
　　肿瘤坏死因子是重要的促炎因子和免疫调节因子。TNF-α在肝损伤中有双重作用，一方面TNF-α能促进肝细胞再生，诱导核因子-κB（NF-κB）的激活;另一方面TNF-α是介导内毒素肝毒性作用的重要介质。TNF-α通过与细胞表面的TNF-α受体结合而起作用。长期饮酒可增加实验大鼠肝细胞表面TNF-α受体的密度，从而增加TNF-α对肝细胞的毒性作用。在肝损伤早期，通过激活NF-κB触发其他细胞因子的分泌，而致肠腔渗透性增加和氧自由基（ROS）产生，加重炎症的损伤。本实验显示，模型组肝组织损害明显，表现为肝组织坏死严重，肝小叶结构破坏，肝细胞呈大片坏死，残留少量肝细胞，肝窦扩张、充血、出血明显，未见肝细胞再生及胆管增生，汇管区及坏死区可见炎症细胞浸润;并且TNF-α与ET、ALT、AST水平呈正相关。提示TNF-α参与了酒精性肝损害的发生，且与血浆中ET吸收有关。与酒精性肝病发病密切相关的白介素主要有IL-6。资料表明，长期饮酒，由于酒精对肠道黏膜的损害，使肠道内毒素吸收增加导致kupffer细胞功能处于高饱和状态，对内毒素的吞噬降解功能减弱，血液中内毒素含量上升，刺激单核细胞和血管内皮细胞过量分泌IL-6，引起肝细胞变性、坏死及纤维组织增生 ［5］  。IL-6是炎症反应性介质，是炎症反应中重要的细胞因子，其主要作用为激活T、B淋巴细胞以及诱导肝脏产生急性应激蛋白。IL-6水平越高，肝损害越重 ［6］  。IL-6等细胞因子可介导一系列免疫反应，造成机体功能衰竭 ［7］  。本实验观察到酒精性肝损伤大鼠血清IL-6明显升高，说明IL-6升高是造成实验性大鼠酒精性肝损伤的重要因素之一。
   
　　研究表明，中医“毒”与西医“内毒素”之间存在着密切的相互关系，在应用中医药治疗内素血症的研究中，基本上遵循“菌毒并治，清下并用，扶正祛邪”的原则 ［4］  。肝毒清颗粒正是基于上述认识组方的。该方为我院治疗慢性乙型肝炎合并内毒素血症的常用有效经验方，主要由茵陈、栀子、大黄、虎杖、败酱草、重楼、白花蛇舌草、丹参、白术、云苓等14味中药组成。方中茵陈、栀子、大黄清热除湿，利胆退黄为君药，其中茵陈善清利肝胆湿热，栀子清泄三焦湿热，大黄凉血逐瘀，清泄肠胃湿热。茵陈配大黄使瘀热从大便而解，茵陈配栀子可使湿热从小便而去，使邪有出路。辅以虎杖、蚤休、白花蛇舌草等能增强清热解毒退黄之作用，丹参、赤芍凉血活血而化瘀;再辅以白术、茯苓健脾除湿，兼以扶正。以上诸药配伍成方，具有清热解毒、凉血活血、利湿退黄的作用，以祛邪为主而不致伤正，苦寒而不碍脾胃为其特点。上述诸药经现代工艺提取其有效成分而制成颗粒剂，既符合传统中医理论“方从法出，以法定方”的原则，又符合现代药理研究，组方严谨、配伍合理，服用也方便。本次实验初步证实了它对酒精性肝损伤大鼠有明显的保护肝功能、改善肝组织病理改变、促进肝功能恢复的作用。推测其机制为通过拮抗内毒素，行使对内毒素等的清除功能、有效调控细胞因子的分泌，如降低TNF-α、IL-6的含量等，抑制其对肝脏进一步的免疫损伤，从而对酒精性肝损害起到一定的保护作用。

　　参考文献
    
　　1 梁扩寰.肝脏病学.北京:人民卫生出版社，1995，398.
   
　　2 卿笃信.内毒素血症与酒精性肝病.国外医学·生理病理科学与临床分册，2001，21（5）:370-372.
   
　　3 王清图.内毒素与酒精性肝病.中国微循环，2001，5（1）:76.

　　4 魏嵋，杨华秀，刘鹏，等.肝毒清颗粒治疗慢性乙型肝炎内毒素血症的临床研究.中西医结合肝病杂志，2002，12（4）:199-201.

　　5 Fujimato M，Uemura M，Nakatani Y，et al.Plasma endotoxin and serum cytokine level in patients with alcoholic hepatitis:relation to severity of liver disturbance.Alcohol Clin Exp Res，2002，24（4Suppl）:48-54.

　　6 张燕，印建.白细胞介素-6水平与病毒性肝炎的关系.中西医结合肝病杂志，1999，9（3）:3.
   
　　7 沈芳，周志统，陈丹红，等.乙型肝炎患者IL-6，IL-8，IL-10的变化.中西医结合肝病杂志，1999，9（5）:31.
    
　　（收稿日期:2004-07-22）

　　（编辑日 强）

　　作者单位:646000四川泸州泸州医学院中西医结合学院
   
　　　　　　　614000四川省乐山市人民医院