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【摘要】 目的 研究豆楮方对人肝癌细胞株HepG 2 的生长增殖抑制作用，从分子生物学角度探讨其抗癌作用机制。方法 文献法制备豆楮方含药血清，用MTT法观察药物作用24h、48h后细胞的增殖情况。结果 豆楮方含药血清在体外对人肝癌细胞株HepG 2 有显著的抑制作用，作用24h的最高抑瘤率为91.48%，作用48h的最高抑瘤率为90.31%，抑瘤效果优于5-FU。结论 豆楮方具有抗肝癌作用。
关键词 豆楮方 人肝癌细胞株HepG 2 实验研究
The Experimental Research on the Inhibiting action of Dou-Chu Formula on the Proliferation of HepG 2 cell line in vitro
Peng Haiyan，Zhang Xiaochun，Zhang Yonghong，et al.
The First Clinical Medical College，Traditional Chinese Medicine University of Nanjing，Nanjing210029.
【Abstract】 Objective To observe the inhibiting action of Dou-Chu formula on the proliferation of HepG 2 cell line in vitro，so as to discuss its anticancer mechanisms.Methods Obtain pharmaceutic serum of the rabbit after feeding itwith Dou-Chu formula for5days.HepG 2 cell line was treated with the pharmaceutic serum at different conˉcentrations for24h and48h respectively.The inhibiting rate of cells was observed byMTT.Results The proliferation of HepG 2 cells was obviously inhibited after being treated with Dou-Chu formula.The best effect for24h was91.48%and that of48h was90.3%.Conclusion Dou-Chu formula has anticancer function.
Key words Dou-Chu formula the proliferation of HepG 2 the Experimental Research
豆楮方是江苏省著名中医肝病专家邹良材的经验方，经尤松鑫教授等继承人发扬光大，自20世纪70年代以来反复实践验证，对于防治慢性乙肝病毒相关性肝癌、肝癌晚期腹水症等具有显著的疗效 ［1］ 。本研究采用血清药理学方法，观察其对人肝癌细胞增殖的抑制作用，从细胞水平探讨其抗肝癌的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物 豆楮方（以下简称DC），由黑料豆、楮实子等组成，由本校中药学院进行严格的质量控制，按临床用药比例、5倍用量，水煎、过滤、浓缩至含生药为1.0g/ml的药液，高压灭菌，4℃存放备用。
1.1.2 主要试剂及设备 RPMI-1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶由美国Gibco公司提供，MTT及其他常用试剂购自四季青公司，二氧化碳培养箱购自德国Hereus，全自动酶标仪购自台湾Ermainc公司。
1.1.3 动物与细胞 日本大耳白兔，由本校实验动物中心提供，雄性，体重2.5kg。随机分为给药组及对照组。人肝癌细胞株HepG 2 、SMMC-7721由本校分子生物实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 含药血清的制备 参考文献 ［2］ 的方法。DC水煎液（1.0g/ml）及生理盐水均按10ml/kg体重，分别给兔灌胃。动物随机分为空白对照组、5-FU阳性对照组、中药大、中、小剂量组，每组3只，每日1次，连续5d后于最后一次灌胃后2h，颈动脉采血，无菌分离血清，灭活后置-20℃储存备用。临用前加入RPMI-1640培养液稀释成相应浓度。
1.2.2 肿瘤细胞悬液制备 将冻存的人肝癌细胞HepG 2 、SMMC-7721按常规方法复苏，接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，弃培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化3min，离心弃上清液，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，苔盼兰染色活细胞计数，调整细胞数为1×10 5 /ml，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液90μl。
1.2.3 MTT法检测 参考文献方法 ［3］ ，将培养的细胞接种于96孔的培养板中，置于37℃、5%CO 2 、饱和湿度的二氧化碳培养箱中继续培养24h，然后分别加入浓度为10%、20%、30%的含药血清，同时设无含药的空白兔血清对照组（空白组）和完全培养液对照组（PBS组），每组6孔。分别继续培养24h和48h，每孔加入MTT溶液，37℃孵育3h，吸去每孔中的培养液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO），振荡后采用酶联免疫反应检测仪测定各孔OD值，测定波长为570nm，调零孔只含有培养液。所得各孔平均OD值按下述公式计算抑瘤率:抑瘤率（%）=（对照组平均OD值-给药组平均OD值）/对照组平均OD值×100%。
1.3 统计学方法 数据采用SPSS10.0for windows统计分析软件分析系统处理。所有数据均以均数±标准差（ˉx±s）表示。进行t检验及方差分析，以P<0.05作为差异有显著性。
2 结果
2.1 作用24h后DC对人肝癌细胞HepG 2 的作用 见表1。结果表明DC对HepG 2 有明显的抑制作用，其OD值与PBS组、空白血清组对照差异均有非常显著性，P<0.001，高浓度含药血清的抑瘤率可达91.48%，高于5-FU组。表1 作用24h后DC对HepG 2 肝癌细胞的作用（略）
注:与5-FU组比较， ˇ P<0.01， △ P<0.05
2.2 作用48h后DC对人肝癌细胞HepG 2 的作用 见表2。结果表明DC对HepG 2 有明显的抑制作用，其OD值与PBS组、空白血清组对照差异均有非常显著性（P<0.001），高浓度含药血清的抑瘤率可达90.31%，高于5-FU组。
表2 作用48h后DC对HepG 2 肝癌细胞的作用（略）
注:与5-FU组比较， ˇ P<0.005
2.3 相同浓度药物血清作用24h与48h后抑瘤率比较 浓度为30%的含药血清作用于HepG 2 24h后的抑瘤率为91.48%，作用于HepG 2 48h后抑瘤率为90.31%，两者OD值差异无显著性（P>0.05）;浓度为20%的含药血清作用于HepG 2 24h后的抑瘤率为83.86%，作用于HepG 2 48h后抑瘤率为81.63%，两者OD值差异有显著性（P<0.05）;浓度为10%的含药血清作用于HepG 2 24h后的抑瘤率为76.23%，作用于HepG 2 48h后抑瘤率为72.96%，两者OD值差异有非常显著性（P<0.01）。本结果表明，高浓度药物疗效维持较好。
3 讨论
在我国，原发性肝癌的发病率与病死率均很高，目前临床上尚无高效低毒的抗肝癌药物，患者确诊后往往生存期很短，加强对防治肝癌的研究具有重要意义。研究资料显示，我国的原发性肝癌患者乙肝病毒（HBV）感染率高达89.6%～95% ［4］ ，近来的分子生物学研究也揭示了HBV与肝细胞癌变的相关性 ［5］ 。
笔者在跟随导师尤松鑫教授的临床实践中，总结了大量的临床资料显示，豆楮方具有较好的防治慢性HBV感染患者发生肝硬化及肝癌病变的作用，并且对肝癌患者发生的腹水病变具有良好的治疗效果。中医学认为，HBV为湿热疫毒之邪，喜嗜于肝，使肝气郁结，久而化火，最易耗伤肝阴。肝为将军之官，体阴用阳，肝阴受损，必失其用，诸症丛生，一方面肝之阴血亏虚，另一方面痰湿瘀毒胶结成癌块。扶正抗癌是防治肝癌的重要治则，而豆楮方的配伍特点正充分体现了养肝而不恋邪，化瘀而不伤阴的治法关键。为了进一步探讨豆楮方防治肝癌的作用机制，本研究采用血清药理学方法探讨其对肝癌细胞的作用，避免了中药特别是中药复方的粗提物直接加入反应体系中进行体外实验所获取的实验结果的不足之处。含药血清含有中药的体内代谢成分及中药的内生性有效成分，使体外试验更能反映中药的体内效应，从而提高实验结果的可信度。本实验结果表明，豆楮方有显著的抗肝癌效果，下一步的实验将深入研究豆楮方对肝癌细胞凋亡机制及基因表达的影响。
参考文献
1 彭海燕，汪悦.尤松鑫治疗乙型肝炎肝硬化经验.中医杂志，2003，44（10）:732.
2 孟李，王宁生.含药血清的制备方法研究.中药新药与临床药理，1999，10（5）:290.
3 Yong-hong ZHANG，Hai-yan PENG，Guo-hao XIA，et al.Antiˉcancer effect of two diterpenoid compounds isolated from Annona glabra Linn.Acta Pharmacol Sin，2004，25（7）:937.
4 陆培新，王金兵，吴一迁，等.乙型肝炎病毒表面抗原携带者队列前瞻性研究在肝癌发生发展中的意义.中华医学杂志，2001，81（14）:856.
5 陆东东.肝炎病毒致肝癌发生的分子生物学研究进展.辽宁医学杂志，2001，15（5）:270.
（收稿日期:2004-10-22）
作者单位:210029江苏南京中医药大学第一临床医学院（ ˇ 通讯作者）
（编辑新 竹）