Literature
首页合作平台在线期刊中华现代中西医杂志2005年第3卷第3期实验研究

草酸铵延长僵蚕凝血酶时间的初步研究

来源:中华实用医药杂志
摘要:【摘要】目的研究草酸铵对僵蚕抗凝作用的影响。方法以凝血酶时间(TT)为指标,用添加法比较不同浓度的草酸铵对僵蚕提取液和凝胶分离液抗凝作用的影响,并以lgTT对草酸铵和僵蚕样品液的浓度进行线性回归处理,考察草酸铵的协同作用。结果添加草酸铵浓度在1。3mg/ml范围内,对固形物含量15。...

点击显示 收起

    【摘要】 目的  研究草酸铵对僵蚕抗凝作用的影响。 方法  以凝血酶时间(TT)为指标,用添加法比较不同浓度的草酸铵对僵蚕提取液和凝胶分离液抗凝作用的影响,并以lgTT对草酸铵和僵蚕样品液的浓度进行线性回归处理,考察草酸铵的协同作用。 结果  添加草酸铵浓度在1.8~21.3mg/ml范围内,对固形物含量15.8~31.6mg/ml的提取液和14.6~29.1mg/ml的凝胶分离液的TT值增加成正相关。对固形物含量15.8~23.7mg/ml的提取液和29.1mg/ml的凝胶分离液的TT提高有最佳草酸铵浓度(即添加草酸铵浓度为7~14mg/ml或0.05~0.1mol/L)。 结论  草酸铵对僵蚕提取液、凝胶分离样品的抗凝作用均有增强作用。

    关键词  僵蚕 草酸铵 凝血酶时间 抗凝作用

    僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori L4~5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana(Bals)Vuill而致死的干燥体。僵蚕的主要活性成分是蛋白质,约占67.44% [1] 。李安国等 [2] 和彭延古等 [3] 研究发现僵蚕提取液对凝血酶时间(TT)、部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)均有明显的延长作用。虫体表面白粉中含有草酸铵,其草酸铵含量随产地和批次不同差别多达2.2倍 [4] ,而它也是僵蚕的药理活性成分之一 [5] 。为此,本实验对草酸铵对僵蚕抗凝作用的影响进行研究,为僵蚕的进一步开发利用提供实验依据。

    1 仪器与试药

    1.1 仪器 Start-4半自动四通道血凝仪(法国STAGO公司)、移液枪(0.1ml和1.0ml),BS100-A自动部分收集器(上海沪西仪器厂)。

    1.2 试药 僵蚕(购自湖南振兴中药饮片有限公司),Sephadex G-25(pharmacia,Biotech公司),草酸铵(A.R.),凝血酶和Tris(sigma公司),血浆,蒸馏水,生理盐水。

    2 方法与结果

    2.1 血浆制备 取新鲜兔全血加3.8%的枸橼酸抗凝,3000r/min,离心10min,分离血浆,于-33℃冷冻保存。

    2.2 僵蚕提取液制备 称取僵蚕适量,用8倍量水浸泡15min,以3000r/min匀浆,煎煮2次,每次0.5h,过滤,合并滤液,离心去渣后浓缩至含生药2g/ml,加无水乙醇至60%的浓度,4℃放置过夜,3000r/min离心,取上清液水浴浓缩至含生药6g/ml溶液,即得。按干燥失重(105℃)方法 [5] 测得固形物含量为224.5mg/ml,按文献方法 [4,6] 用高锰酸钾法测得此提取液中草酸铵含量为22.4mg/ml,适当稀释得各实验提取液。

    2.3 凝胶分离样品制备 将20ml僵蚕提取液加到用0.05mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH7.4)缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱(φ2.6cm×80cm)上,用相同缓冲液洗脱,2.5ml/管·10min,用自动分步收集器收集,每2~3管测定凝血酶时间,得洗脱曲线如图1。取TT>600s的馏分,适当稀释,按干燥失重(105℃)方法 [5] 测得固形物含量为58.2mg/ml,按文献方法 [5,6] 用高锰酸钾法测草酸铵含量为4.20mg/ml,即为凝胶分离液。

    图1 僵蚕提取液的凝胶色谱图

    2.4 TT测定方法 凝血酶试剂用生理盐水稀释混匀后放置在试剂预热台预热5min,2h内用完。取0.1ml血浆放入比色杯中,加入0.1ml样品或生理盐水,预温3min,加入0.1ml凝血酶,仪器开始测试,记录凝血时间。用生理盐水作空白,调节凝血酶的浓度使凝血时间为16~18s。

    2.5 仪器精密度考察 用24mg/ml的草酸铵溶液重复测定8次,得TT(s)分别为69.4、68.9、68.3、66.5、64.5、66.1、65.8、67.2,ˉx=67.1,RSD=2.5%,表明仪器精密度良好。2.6 僵蚕提取液、凝胶分离液和草酸铵溶液的TT测定 将僵蚕提取液、凝胶分离液和草酸铵分别用蒸馏水稀释至不同浓度,按2.4项下方法测定TT,结果见表1。从表1可得在23.6~63.1mg/ml的提取液浓度范围内,lgTT对浓度(C)的回归直线方程为lgTT=0.0244C+1.033,r=0.995;在14.6~58.2mg/ml凝胶分离液浓度范围内,lgTT对浓度C的回归直线方程为lgTT=0.0327C+0.871,r=0.992;在3.6~42.6mg/ml的草酸铵浓度范围内,lgTT对浓度C的回归直线方程为lgTT=0.0323C+1.065,r=0.997。以上经相关系数检验均有P<0.01。表明以上三种溶液的lgTT均与其浓度的线性关系良好,即TT与三种溶液的浓度均呈正相关,具有非常显著的意义。而且用各回归方程求得的浓度与已知浓度相比的相对误差(即线性误差)不超过7%,表明此方法的精密度和可靠性较好。

    表1 样品不同浓度(C)的TT(s)(略)

    表2 不同浓度草酸铵对僵蚕提取液和凝胶分离液的TT(s)的影响(略)注: * 指样品液用蒸馏水稀释1倍将表2测得的TT值按2.6项下的回归方程分别计算出相应的样品浓度(称为计算浓度),将测定液浓度和加入的草酸铵浓度相加(称为实际浓度),以此二者之差与实际浓度之比计为TT活性提高率(%),将其对加入的草酸铵浓度,结果见图2。

    图2 草酸铵对僵蚕样品TT活性的提高率(%)
   
    从图2的结果可以得到1~5号样品的lgTT与加入的草酸铵浓度的回归直线方程的相关系数(r)分别为0.995、0.981、0.959、0.934、0.998,经相关系数检验P<0.01(f=4,r=0.917,P=0.01),即不同浓度样品的lgTT均与加入的草 酸铵浓度成正相关,且具有非常显著的意义。

    3 讨论

    3.1 草酸铵对延长僵蚕凝血酶时间具有协同作用 表2的结果表明无论是僵蚕提取液(15.8~31.6mg/ml)还是凝胶分离液(14.6~29.1mg/ml),1.8~21.3mg/ml的草酸铵溶液均使其凝血酶时间成指数增加,并具有非常显著的统计学意义(相关系数检验P<0.01)。图2的结果表明不同的草酸铵浓度对各种浓度样品液的TT活性提高率不尽相同。对提取液而言,提取液浓度低时,草酸铵对TT活性的影响有极大值,即有最佳草酸铵浓度(即添加草酸铵浓度为7~14mg/ml或0.05~0.1mol/L),而对于凝胶分离液,则浓度高时,有最佳草酸铵浓度(0.05mol/L)。另外,加草酸铵后,TT值增加不大(如增加在10s以下)时,则对TT活性无影响。用表2中的lgTT对各实际浓度(C)求回归直线方程,结果见表3,将其与2.6项下的提取液、凝胶分离液及草酸液的1gTT-C回归直线方程比较。结果表明样品液中加入草酸铵后,各回归直线的斜率均明显增加,增加越大表示草酸铵的影响越大。说明草酸铵与僵蚕中的抗凝成分有较强的协同作用。另外,同一样品其浓度不同,直线方程的斜率或截距不同,但lgTT-C仍呈线性,其相关系数检验有P<0.01,说明草酸铵与僵蚕的抗凝成分发生协同作用的机制可能有差别,有待进一步研究。

    表3 添加草酸铵后僵蚕提取液和凝胶分离液的回归直线方程(略)
 
    3.2 采用添加法研究草酸铵对延长僵蚕凝血酶时间的协同作用 文献 [7] 采用过量CaCl 2 溶液沉淀法去草酸铵,再用磺酸型离子交换树脂除去剩余的Ca 2+ ,研究草酸铵对僵蚕抗惊厥作用的影响,这样忽略了树脂上交换了除Ca 2+ 以外的物质的作用。本文用添加法,则不存在上述问题。另外,本文对草酸铵的协同作用采用了数学分析方式进行处理,以了解僵蚕样品抗凝作用的差别和方法的可靠性。

    参考文献

    1 徐国均,何宏贤,徐珞珊,等.中国药材学(下).北京:中国医药科技出版社,1996,1797-1800.

    2 李安国,彭延古,邓常青,等.僵蚕提取样品抗凝活性初步研究.湖南中医学院学报,1992,12(3):37-39.

    3 彭延古,葛金文,邓奕辉,等.僵蚕抗凝活性成分的研究.湖南中医学院学报,2000,20(4):18-19.

    4 丁亚平,吴庆生.示波电位滴定发法测定僵蚕中草酸铵.分析实验室,1997,19(5):14-16.

    5 王金华.僵蚕与僵蛹活性物质的研究与应用.时珍国医国药,2003,(14):492-493.

    6 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典(二部)附录.北京:人民卫生出版社,2000,180.

    7 中国科学院药物研究所.僵蚕和僵蛹的抗惊作用及其有效成分研究.中草药通讯,1978,(12):24-26.

    (编辑建 光)

    * 基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30171159)
    作者单位:410004长沙湖南中医学院药学院( △ 科研处)

作者: 彭新君 赵建国 彭延古 △ 曾序求 △ 江星明 2005-9-22
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具