点击显示 收起
【摘要】 目的 测定金地颗粒中绿原酸的含量。 方法 反相高效液相色谱法。色谱柱:反相C 18 柱Kromasil C 18 （4.6×250mm，5μm）。流动相:乙腈-1%磷酸水溶液（9∶19）（V/V）。测定波长:327nm。 结果 样品HPLC色谱图中绿原酸与其他峰呈良好分离。浓度在6.64～212.4μg/ml之间绿原酸峰面积与浓度线性关系良好，回归方程:Y=（3.865×10 4 ）X-24569.6（r=0.9996）。最低检测限量为0.3ng。 结论 方法简便可行，结果可靠。
关键词 绿原酸 金地颗粒 反相高效液相色谱法
金地颗粒由金银花、生地等五味中药组成，具有清热解毒、滋阴润燥的功效，安全无毒，作用迅速、口感好、剂量小。绿原酸为其主要有效成分，可以准确定量，故将其定为本制剂含量测定的指标成分。目前已知的绿原酸含量测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱（HPLC）法等。笔者采用HPLC法测定制剂中绿原酸含量，用以对制剂质量进行控制，该方法可靠、灵敏、快速。
1 仪器与材料
1.1 仪器和试剂 Waters515泵，Waters2487紫外-可见检测器，Rheodyne进样器，中科院大连化学物理所WDL-95色谱工作站。乙醇为色谱纯（美国Tedia公司产品），水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
1.2 对照品来源及纯度检查 绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号:110753-200212）。以浓度0.2124mg/ml采用高低浓度自身对照法进行对照品纯度检查，结果绿原酸标准品纯度为99.21%。此外，采用“面积归一化”法测定绿原酸标准品纯度为98.65%。
2 方法与结果
2.1 色谱条件的选择 色谱柱:反相C 18 柱Kromasil C 18 （4.6×250mm，5μm），淮阴汉邦科技公司;反相C 18 柱Lichro-spher C 18 （4.6×250mm，5μm），淮阴汉邦科技公司。结果显示，两根不同的色谱柱均能达到良好分离，但以Kromasil C 18 色谱柱较好，故选用。流动相:以乙腈-1%磷酸水溶液系统为流动相进行色谱分析，流动相为乙腈-1%磷酸水溶液（9∶91）（V/V）。测定波长:据绿原酸的紫外吸收光谱，其最大吸收波长为327nm，故将其测定波长确定在327nm。柱温:30℃。
在上述条件下，样品HPLC色谱图中绿原酸与其他峰呈良好分离。为确保定量分析的准确性，在系统实验中绿原酸理论塔板数不得低于2500。重复二支Kromasil C 18 色谱柱，均能达到上述指标，符合要求。经绿原酸为对照液对系统的重复性进行了考察，RSD%为0.19%，符合规定见表1。
表1 绿原酸对照液的重复性（略）
2.2 供试品溶液的制备 取本品装量差异项下颗粒，研细，取0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加入50%甲醇约40ml，超声处理30min，置冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。样液经高速离心（转速10000rpm）10min，取上清液，即得。
2.3 线性关系的考察 绿原酸的标准曲线绘制:精密称取绿原酸对照品5.31mg，置于25ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，制成绿原酸标准贮备液（212.4μg/ml）。采用逐级稀释法再分别配成106.2μg/ml、53.1μg/ml、26.55μg/ml、13.28gμg/ml、6.64μg/ml的系列对照品液，分别吸取上述溶液5μl，液相色谱仪进样器，测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品量（μg/ml）为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程:Y=（3.865×10 4 ）X-24569.6（γ=0.9996）绿原酸浓度在6.64～212.4μg/ml之间，呈良好的线性关系。结果见表2。
表2 绿原酸线性关系考察（略）
2.4 空白试验 原方去除金银花药材，按制剂工艺法进行制备，得缺金银花的空白制剂。取空白制剂粉末0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加入50%甲醇50ml，称定重量，超声提取30min，置冷，称定重量，补足溶剂减失量，静置，取样，离心10min（转速1000rpm），取上清液，即得。按含量测定方法分析，空白样品的色谱在绿原酸相应保留时间处无干扰峰。说明:在本条件下，测定绿原酸含量无干扰，本方法准确、可行。
2.5 稳定性试验 同一样品（批号040822）供试液，隔2h测1次，共测6次，测定结果见表3。结果表明，供试液中绿原酸在10h内稳定，RSD为1.24%，符合要求。
表3 制剂中绿原酸的稳定性考察结果（略）
2.6 提取方法试验 为了尽可能地提出制剂中的绿原酸，对提取溶剂、提取时间分别进行了考察，取批号为040822的制剂1.0g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，分别加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇及流动相约40ml，超声提取15min，定容至50ml，样液经高速离心（10000rpm）10min取上清液，即得。结果见表4。取制剂0.6g，精密称定，按上法操作，分别超声15min、30min、45min、60min，测定结果见表5。表4 制剂中绿原酸提取溶剂选择（略）注:以50%甲醇为提取溶剂，提取率较高表5 制剂中绿原酸超声时间选择（略）注:同等条件下，超声30min，提取率高以上结果表明:以50%甲醇为提取溶剂，超声提取30min，能使制剂中的绿原酸提取较为完全。
2.7 精密度试验 同一供试液（批号040822），依法测定，连续进样6次，测定峰面积结果见表6。表6 制剂中绿原酸的精密度考察试验结果（略）注:供试液中绿原酸的RSD为1.24%，符合要求
2.8 重复性试验 同一批号（批号040822）制剂，依法处理样品6份，依法测定，重复性结果绿原酸的平均含量为0.336%，RSD=2.99%，见表7。 表7 制剂中绿原酸的重复性试验结果（略）
2.9 检测灵敏度及检测下限 当绿原酸进样量0.3ng时，呈现0.25mV强度的色谱峰，信号与噪音之比约为3，故样品检测的最低限量为0.3ng。
2.10 回收率试验 精密称取本品（040822）约80mg，置于10ml棕色容量瓶中，共6份，2份1组，各组分别加入绿原酸对照品溶液（0.2124mg/ml）1.2ml，1.0ml，0.8ml。依法测定，计算绿原酸平均回收率为100.52%，RSD=2.28%。结果见表8。表8 加样回收率试验结果（略）
2.11 样品测定 三批号（批号040822、040826、040828）制剂样品，如法测定。样品测定结果见表9。表9 制剂中绿原酸的含量测定结果（略）
外标一点法与标准曲线法结果比较:计算公式:标准曲线法公式:绿原酸含量（mg/袋）=标准曲线计算出浓度（mg/ml）×50（ml）×9（一袋颗粒重）/［称重（g）］外标一点法公式:以0.0872mg/ml绿原酸对照品溶液进样测定，峰面积为3.346×10 6 ，按药典法计算含量，与标准曲线法比较结果如下（见表10）: mi=m r ×Ai Ar
绝对校正因子=0.0872÷（3.346×10 6 ）=2.606×10 -8 绿原酸含量（mg/袋）=Ai×2.606×10 -8 ×50（ml）×9（一袋颗粒重）÷称重（g） =Ai×1.173-5÷称重（g）
表10 外标一点法与标准曲线法的结果比较（略）
上述测定结果表明，外标一点法与标准曲线法测定结果非常接近，因此在质量标准正文中采用外标一点法进行测定。
2.12 含量限度 测定三批不同样品的含量，结果见表11。表11 三批制剂绿原酸含量（略）
本品三批供试成品的平均值为29.78mg/袋，考虑到实际生产时各批之间的差异，故以-20%为下限，含量限度定为每袋含绿原酸不低于24mg。
3 讨论
以HPLC法测定金地颗粒的主要有效成分绿原酸的含量，方法简便，结果准确可靠，可用于该制剂的质量控制。
（编辑唐 城）
作者单位:210089江苏南京南京中医药大学