还少丹对老年大鼠肝细胞老化改变的影响

    【摘要】  目的  探讨还少丹对老年大鼠肝细胞老化改变的影响。方法  以24只健康SD老年大鼠为研究对象，用还少丹水煎液给药物组老年大鼠灌胃，用等量生理盐水给对照组大鼠灌胃，80天后断头处死大鼠，取鼠肝提取DNA，用碱变性法检测鼠肝DNA增色效应：用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法和荧光光度法分别测定鼠肝丙二醛（malondialdehyde，MDA）和脂褐素（lipofuscin，LF）含量。结果  还少丹能显著降低鼠肝碱变性增色效应（P＜0.01）；并能降低鼠肝丙二醛和脂褐素的含量，结果差异均具有非常显著性（P＜0.01）。结论  （1）鼠肝DNA碱变性增色效应、丙二醛和脂褐素含量的改变，反映了肝细胞的老化过程；（2）还少丹具有拮抗鼠肝衰老的作用。

    【关键词】  抗衰老；碱变性；增色效应；丙二醛；脂褐素

    Effects of huanshaodan on aging change in aging rats liver cells

    LIU Qun-liang，ZHANG Yue-juan，HU Mei，et al.Department of Biochemistry，Hunan College of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007，China

    【Abstract】  Objective  To explore the effects of huanshaodan on aging change in aging rats liver cells.Methods  Twenty-four healthy SD aging rats were used.The treatment group received gastric perfusion of Huanshaodan decoction，those in the control group were treated with gastric perfusion of saline of the same volume，for 80 days.The heads of rats were cut down for DNA obtained from the rats liver.The hyperchromic effects of DNA in the liver cell of old rats were detected with alkalis denaturation method.The contents of malondialdehyde and lipofuscin in the liver of old rats were detected with thiobarbituric acid and fluorospectrophometer analysis methods.Results  Huanshaodan could not only remarkably decrease the hyperchromic effect of alkalis denatured DNA in the liver of old rats (P＜0.01)，but also remarkably decrease the contents of malondialdehyde (P＜0.01) and lipofuscin (P＜0.01) in the liver of old rats.Conclusion  (1)The changes of the hyperchromic effect of alkalis denatured DNA and the contents of malondialdehyde and lipofuscin in the old rats liver，reflected the process of aging in liver cell.(2)Huanshaodan has the function of anti-aging in the liver of old rats.

    【Key words】  anti-aging;alkalis denatured;hyperchromic effect;malondialdehyde;lipofuscin

    随着年龄的增长，肝染色体DNA损伤增加，细胞的氧化损害增加，生物大分子交联反应增多。如果这些损伤不能及时修复就会阻碍肝细胞的正常代谢与功能，造成细胞的衰老以至死亡。祖国医学认为衰老的主要原因是肾气衰退。本研究选用补肾延年的还少丹，以DNA碱变性增色效应、MDA和LF为检测指标，探讨中医抗衰古方对老年大鼠肝DNA损伤和脂褐素的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物与仪器药品  健康SD老年大鼠，21月龄，由湖南农业大学实验动物中心提供，雌雄各半，雄性大鼠体重（643.74±61.04）g，雌性大鼠体重（505.32±60.31）g。还少丹煎液，由何首乌、熟地、肉苁蓉等中药组成（购自湖南省药材公司）。丙二醛和脂褐素测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。F-4500荧光光度计（日本HITACHI公司产品）；UV-9200紫外分光光度计和VIS-7220可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司产品）。

    1.2  还少丹提取物的制备  将310g中药加水800ml，煎煮1h，离心过滤；滤渣再加水煎煮1h，离心过滤；合并两次滤液，混匀，加热浓缩成1g/ml的还少丹水煎液，置冰箱中保存备用（冰箱中保存时间不超过4天）。

    1.3  动物分组与给药方法  依大鼠性别、体重分层，随机分成老年对照组和老年药物组，每组12只。药物组用还少丹水煎液灌胃2ml/（kg·d）（含生药7g），其药物剂量按人体体表面积方法计算，大鼠灌胃剂量相当于成人剂量的5倍，对照组用等量生理盐水灌胃，灌胃5d/周，另2天自由饮药。饲喂80天。

    1.4  鼠肝DNA增色效应的检测  大鼠饲喂80天后，断头处死，参照萨姆布鲁克等［1］的方法，取鼠肝提取DNA。参照徐桂香等［2］法，检测鼠肝DNA增色效应，以ApH12.5表示pH12.5时的A260，ApH7.0表示ApH7.0时的A260，按［（ApH12.5-ApH7.0）/ApH7.0］×100%计算DNA碱变性增色效应。

    1.5  鼠肝丙二醛和脂褐素的检测  参照陈奇等［3］方法，在532nm处测OD值，测定丙二醛含量；脂褐素的检测，用氯仿与甲醇混合液萃取，用荧光分光光度计以0.1μg/ml的奎宁液为标准，氯仿甲醇混合液为空白，狭缝4.4，灵敏度3.6，激发波长360nm、发射波长450nm测其荧光强度，计算脂褐质的含量。

    1.6  统计学方法  采用SPSS 11.5统计学软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。

    2  结果

    2.1  还少丹对老年大鼠肝细胞染色质DNA损害的保护作用  结果见表1。

    表1  还少丹对老年大鼠肝DNA碱变性增色效应的影响  （略）注：与老年对照组比较，老年大鼠肝DNA碱变性增色效应平均降低率为31.4%，t=3.02，*P＜0.01。由于动物死亡和测定样品的损失，表内动物数少于分组时的动物数，下同由表1可见，老年药物组大鼠肝DNA碱变性增色效应显著低于老年对照组，其降低率为31.4%，说明还少丹具有阻抗肝DNA损伤的作用。

    2.2  还少丹对老年大鼠肝细胞损害的保护作用  结果见表2、表3。

    表2  还少丹对老年大鼠肝MDA含量的影响  （略）注：与老年对照组比较，老年大鼠肝MDA的平均降低率为48.8%，t=8.99，*P＜0.01

    由表2可见，老年药物组的肝MDA含量显著低于老年对照组，其降低率为48.8%，说明还少丹能抑制衰老进程中过氧化脂质的生成。

    表3  还少丹对老年大鼠肝脂褐素含量的影响  （略）注：与老年对照组比较，老年大鼠肝脂褐素平均降低率为50.7%，t=3.25，*P＜0.01

    由表3可见，老年药物组肝脂褐素含量显著低于老年对照组，其降低率为50.7%，说明还少丹能降低肝脂褐素的生成。

    3  讨论

    众多学者认为衰老的重要机制之一是染色体DNA结构损伤，其损伤包括基因突变和DNA链断裂。DNA链断裂后，断裂的DNA链易变性，导致DNA增色效应增高。衰老生物在长期生活过程中，因受到各种物化因素的攻击，可导致DNA链断裂增加，而DNA链断裂数越多，碱变性增色效应亦越高。徐桂香等［2］报道老年大鼠肝DNA碱变性增色效应高于青年大鼠，说明DNA链断裂随年龄的增加而增加。DNA链断裂直接影响基因信息的正常表达，基因表达异常可产生突变的蛋白质；基因表达障碍使蛋白质表达量降低，可导致老年性记忆减退、智力障碍及肌肉萎缩等症。近年来，关于自由基和活性氧损害DNA，导致DNA断裂或突变的证据越来越多。宗峰［4］报道由过氧化氢所引起的DNA的氧化损伤能极大地提高重复序列的不稳定性。Harley等［5］报道端粒长度随着细胞逐代相传而缩短，说明DNA单链断裂发生于染色体末端，导致端粒缩短加快。以上证实了DNA断裂与衰老的关系，本实验老年药物组大鼠肝DNA碱变性增色效应低于老年对照组大鼠，说明还少丹具有拮抗DNA链断裂、保护DNA结构免受损害的作用。同时，我们从实验中发现还少丹具有抗自由基和活性氧［6］的作用，该方可能是通过抗自由基和活性氧的机制控制了DNA的断裂损伤，这一观点亦支持了殷铭俊等［7］报道的抑制脂质过氧化作用，可防止DNA链断裂的观点。肝脏是物质代谢中心，被誉为“最大的化工厂”。肝细胞每时每刻都在进行各种代谢变化，而物质代谢过程中不断产生自由基，机体能有效地清除自由基，从而防止了自由基对机体产生毒害作用。但是，随着年龄的增长，机体清除自由基的能力下降，导致自由基积聚，如过氧化脂质的代谢产物丙二醛能与蛋白质发生交联，生成脂褐素。脂褐素是一种不溶性颗粒，沉积在肝脏，可影响肝细胞的代谢与功能，因它无法被降解，可能与肝纤维化相关。在延缓衰老的研究中，zweda等［8］论述了脂褐素与衰老的相关性；殷铭俊等［7］报道氧化应激与肝纤维化密切相关，天然中药抗氧化成分能抑制肝纤维化的作用；林刚等［9］用实验证明了抗衰老中药能降低老年大鼠肝脂褐素的含量；庄雪珠等［10］论述了首乌能抑制脂褐素在人体器官内的沉积，本实验还少丹能降低老年大鼠肝MDA和脂褐素的含量，其结果与徐晓虹［11］研究的葛根素使衰老小鼠肝脏MDA和脂褐素含量明显下降的作用是一致的。综上所述，自由基和活性氧损害DNA，导致肝DNA断裂增加；肝脂质过氧化产物MDA和脂褐素的含量随氧化作用的增强而增多，造成对肝脏的损害，也是肝衰老的主要原因。本研究的中医古方还少丹具有补肾益精，使人延年益寿的作用。本研究的结果分析提示：还少丹通过提高老年大鼠清除自由基和活性氧的能力，达到了延缓肝衰老的目的。

    【参考文献】

    1  萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯（著）.金冬雁（译）.分子克隆实验指南，第2版.北京：科学出版社，1998，474-480.

    2  徐桂香，郭语彬，张克纯，等.DNA碱变性增色效应及其老化性改变的实验研究.中国老年学杂志，1996，16（1）：41-42.

    3  陈奇，邓文龙，张进玮，等.中药药理研究方法.北京：人民卫生出版社，1996，940-964.

    4  宗峰.氧化应激、端粒长度与衰老.国外医学·老年医学分册，2003，24（4）：151-153.

    5  Harley CB.Telomeres shorten during aging of human fibroblasts.Nature，1990，345：458.

    6  刘群良，张月娟，胡梅，等.老年小鼠清除活性氧能力与DNA端粒长度变化与还少丹的干预效应.中国临床康复，2005，9（19）：21.

    7  殷铭俊，陈执中.天然药物抗氧化活性成分研究进展.中国民族民间医药杂志，2005，73：65-69.

    8  Szweda PA，Camouse M，hundberg KC，et al.Aging，lipofuscin formation，and free radical-mediated inhibition of cellular proteolytic systems.Ageing Res Rev，2003，2(4)：383-405.

      林刚.山药及盾叶薯蓣对家蚕寿命和小鼠LPO、LF的影响.南昌大学学报，2002，26（4）：363-366.

    10  庄雪珠.中医中药抗衰老.医院管理，2004，7（1）：75.

    11  徐晓虹.葛根素抗D一半乳糖致衰老小鼠的脂质过氧化作用.中国中药杂志，2003，28（1）：66-69.

     (编辑：杜文燕)

    基金项目：湖南省教育厅资助课题（编号：02C291）
    作者单位： 410007 湖南长沙，湖南中医学院生物化学教研室