电针对脑缺血再灌注大鼠海马细胞因子TNF-α、IL-6含量的影响

　　【摘要】  目的  探讨脑缺血再灌注后大鼠海马炎性细胞因子TNF-α、IL-6含量的变化及电针对其的影响。方法  采用改良线栓法制备局灶型脑缺血（MCAO）再灌注模型，电针“大椎”、双侧“内关”穴。用放射免疫法观察正常组、假手术组、模型24h组、模型48h组、模型72h组、电针治疗24h组、电针治疗48h组、电针治疗72h组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6含量的变化。结果  脑缺血再灌注模型各时相大鼠缺血侧海马组织TNF-α含量明显升高，24h出现高峰，与正常组、假手术组比较差异有显著性（P<0.05）；电针治疗组大鼠缺血侧海马组织TNF-α含量逐渐回落，与模型组同时相比较差异有显著性（P<0.05）。电针治疗组大鼠缺血侧海马组织IL-6含量升高明显，与模型组同时相比较差异有显著性（P<0.05），48~72h IL-6含量维持在较高的水平。模型组各时相大鼠缺血侧海马组织IL-6含量也有升高，与正常组、假手术组比较差异有显著性（P<0.05）。结论  电针可降低MCAO再灌注模型大鼠海马组织TNF-α的水平，升高IL-6的水平，减少炎症反应引起继发的神经元损伤，发挥神经保护作用。

　　【关键词】  电针；脑缺血再灌注；海马；TNF-α；IL-6

　　Effects of acupuncture on the content of TNFα and IL6 of cytokine in hippocampus of rat brain after cerebral ischemia/reperfusion

　　KONG Lihong，ZENG Xiao-ling，ＲEN Jie.Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China

　　【Abstract】  Objective  To investigate effects of acupuncture on the content of TNFα and IL6 in hippocampus of rat brain after cerebral ischemia/reperfusion.Methods  SD rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model 24h group，model 48h group，model 72h group，electroacupuncture treatment 24h group，electroacupuncture treatment 48h group，electroacupuncture treatment 72h group.Establish to block the rats middle cerebral artery（MCAO） reperfusing model with the suture in MCA.“Dazhui”，“Neiguan” of both side were electroacupunctured.Detected the content of TNFα and IL6 in hippocampus by immunohistochemistry and by radioimmunoassay（RIA）.Results  The content of TNFα and IL6 in hippocampus of model group rats were significantly higher than those of normal and sham operation group rats（P<0.05），while after electroacupuncture，the content of TNFα were significantly decreased with the lapse of time（P<0.05）；the content of IL6 were significantly increased（P<0.05），content peak of TNFα were appeared at 24h，content peak of IL6 were appeared at 48h.Conclusion  Electroacupuncture may increase content of IL6 and decrease content of TNFα in hippocampus of rat brain after cerebral ischemia/reperfusion.Cut down neuronal cells impairment by inflammation reaction，and has protection effects on neuronal cells after cerebral ischemia/reperfusion in rats.

　　【Key words】  electroacupuncture；cerebral ischemia reperfusion；hippocampus；TNFα；IL6

　　研究表明，急性炎症反应在缺血再灌注损伤所引发的继发性脑损伤中起着关键作用。缺血后再灌注可快速导致炎性细胞因子的表达，如TNF-α、IL-6、IL-1等，具有神经保护及神经毒性双重作用，并通过某些信号转导，级联反应，诱导基因的表达，引起继发的神经元损伤或阻滞神经元损伤。本试验通过观察各组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6含量的变化、电针对其含量的影响，以研究电针对局灶性脑缺血再灌注后神经元损伤的保护作用的可能机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组  清洁级健康SD大鼠62只，雌雄不限，体重为（200±20）g，由湖北中医学院实验动物中心提供。于实验前1周一次性购进，饲养于安静、温暖且避强光的环境中，室温（22±2）℃，自由饮水饮食。随机分为4组：正常对照组6只，假手术对照组18只，模型组18只，模型加电针组18只。余下4只以造模备用。

　　1.2  试剂及主要仪器  TNF-α、IL-6放射免疫试剂盒，购于北京科美东雅生物技术有限公司；50mM醋酸缓冲液（pH 4.75）、无水乙醇、生理盐水，由武汉大学同济医学院组胚教研室提供（北京中山生物技术有限公司）。LG-10低温高速离心机（北京医用离心机厂）；GC-1200γ放射免疫计数器（中国科技大学科技实业公司中佳光电仪器分公司）。

　　1.3  造模方法及模型筛选

　　1.3.1  线栓的制备  选择直径为0.26~0.28mm单股缝合尼龙线，长60mm，将插入端加热熔化，使之成为光滑球面，直径约0.30mm，用酒精清洁后置于生理盐水中备用。

　　1.3.2  脑缺血再灌注模型制备  局灶型脑缺血（MCAO）再灌注模型的建立采用改良线栓法［1］。大鼠造模前禁食不禁水24h，称重后，以10％水合氯醛（0.3ml/100g）进行腹腔麻醉并保温。麻醉大鼠取仰卧位，常规皮肤消毒后，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉（CCA），分离出颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）。电凝ECA入脑分支，结扎游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉（PPA），并在其起始部位置一动脉夹。先将CCA用动脉夹夹住，再在ECA残端剪0.2mm的小口，将栓线插入。轻推尼龙线尾端经CCA分叉部沿ICA入颅，至大脑中动脉（MCA），遇阻即止。尼龙线插入深度约18mm，30min后，抽取栓线对大鼠进行脑缺血再灌注，缝合切口后，用碘酒消毒，动物保温喂养，注意观察造模大鼠生理指征。

　　1.3.3  模型的筛选标准  采用Zea-longa［2］MCAO再灌注模型的建立采用改良线栓法［3］评分方法，当造模大鼠清醒后，即评定动物神经功能缺损。0分：正常。1分：对侧肢体屈曲；2分：拖住尾巴后拉时，对侧肢体无力；3分：拖住尾巴后拉时，向对侧转圈；4分：自发向对侧转圈或倾倒；5分：无任何自发活动。只有神经功能障碍在1分以上的大鼠才视为成功模型。

　　1.4  实验动物处理方法  正常对照组：6只，正常给水给食，不予处理。假手术对照组：18只，大鼠麻醉切开颈部皮肤后，仅分离CCA、ECA及ICA至PPA，不插线栓。按时相分为24h、48h、72h 3组，各6只。模型组：18只，栓塞30min后再灌注。按时相分为24h、48h、72h 3组，各6只。电针治疗组：18只，栓塞30min后再灌注。按时相分为24h、48h、72h 3组，各6只。造模成功后进行电针治疗，参照华兴邦制定的《实验动物穴位图谱》取大椎、双侧内关穴。大椎与缺血侧（右侧）内关接通G-6805电针治疗仪，采用连续波，频率120次/min，强度1mA，以局部肌肉轻微抖动为度，每次持续刺激30min。于缺血再灌注后3h针刺1次，以后每12h针刺1次。

　　1.5  标本制备  动物完成观察时间后，在大鼠尽量安静的条件下迅速断头取脑，在冰盘上迅速分离出病灶侧（正常组相对应侧）的海马区脑组织，称取50mg左右置于冰浴中盛有50mM醋酸缓冲液（pH 4.75）的匀浆器中，将组织粉碎匀浆后的悬浮液移入10ml试管内，用2ml无水乙醇洗匀浆器，然后将洗后的乙醇倒入悬浮液内静置5min，3500rpm离心15min，将上清液收集在青霉素小瓶内，再用75%乙醇1ml洗匀浆器连续2次，用该2ml 75%乙醇洗沉淀、混匀，3500rpm离心15min，合并上清液，60℃水浴中吹干，4℃保存备测。

　　1.6  TNF-α、IL-6含量测定  TNF-α、IL-6含量测定用放射免疫法，具体操作依据试剂盒说明书进行。

　　1.7  统计学方法  所有数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较若满足正态性且方差齐，采用方差分析和q检验，否则采用H检验和q检验。所有数据均输入计算机，以SPSS 11.0软件统计包处理。P<0.05设为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  电针对大鼠海马组织TNF-α含量的影响  从表1可见，假手术组大鼠海马组织TNF-α含量虽有一定升高，但与正常组比较差异无显著性（P>0.05）；模型组各时相大鼠缺血侧海马组织TNF-α含量明显升高，24h出现高峰，48~72h其含量仍维持在较高水平，与正常组、假手术组比较差异有显著性（P<0.05、P<0.01）；治疗组大鼠缺血侧海马组织TNF-α含量随时间的推移回落，逐渐趋于正常，与模型组同时相比较差异有显著性（P<0.05）。

　　表1  各组大鼠海马组织TNF-α含量比较  （略）

　　2.2  电针对大鼠海马组织IL-6含量的影响  从表2可见，假手术组大鼠海马组织IL-6含量虽有一定升高，但与正常组比较差异无显著性（P>0.05）；脑缺血再灌注模型各时相大鼠缺血侧海马组织IL-6含量均有升高，与正常组、假手术组比较差异有显著性（P<0.05、P<0.01），48h出现高峰；治疗组大鼠缺血侧海马组织IL-6含量升高更明显，与模型组同时相比较差异有显著性（P<0.05、P<0.01），48~72h IL-6含量维持在较高水平。

　　表2  各组大鼠海马组织IL-6含量比较  （略）

　　炎性细胞因子是一组由淋巴细胞、单核巨噬细胞和血管内皮细胞等产生的免疫活性因子，包括IL-1、IL-6和TNF等。它们共同参与机体免疫反应、应激反应和炎症的调节。近年来的基础和临床研究发现，细胞因子在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。脑缺血再灌注后激活的脑组织细胞可分泌多种细胞因子，其中主要的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1（IL-1）等，这些炎性细胞因子通过“细胞因子网络”，可对中枢神经系统发挥神经营养、神经保护及神经毒性双重作用。而且多数学者认为炎性细胞因子对中枢神经系统的作用依浓度而不同，正常神经细胞表达低浓度的IL-1、IL-6和TNF，有中枢免疫介导、神经修复等生理作用，而缺血状态下高浓度的炎性细胞因子则可能参与了神经损伤［3，4］。

　　TNF-α和IL-6除各自独特的生物学作用外，因共同参与机体的免疫反应，并在其中互相补充、互相促进、互相制约，在炎症、应激反应中形成细胞因子网络。实验表明早期的炎症反应会加重脑缺血后神经细胞的损伤，晚期的炎症反应对脑缺血神经细胞的再生和恢复有益［5］。本实验选用督脉的“大椎”、手厥阴心包经的“内关”两穴，观察电针对局灶性脑缺血再灌注损伤后海马组织细胞因子TNF-α、IL-6含量的影响。研究表明，在脑缺血再灌注后24ｈ缺血侧海马区TNF-α达高峰，直至72ｈ仍维持较高水平；在脑缺血再灌注后48ｈ缺血侧海马区IL-6达高峰；提示TNF-α和IL-6在脑组织易损区表达的高峰时段，升高程度不尽一致，可能与缺血再灌注早期IL-1、TNF-α激活而后诱导IL-6合成有关。本实验结果表示，TNF-α和IL-6高峰表达时与以往研究不同，可能与观察的时间段、部位、模型的制备有关，也可能TNF-α和IL-6的表达有几个峰值存在？但它们均显示与脑缺血再灌注损伤有直接的相关。电针治疗组可降低大鼠缺血侧海马组织TNF-α的水平，升高IL-6的水平，结合前期实验：电针抗凋亡的结果，我们推测，IL-6延迟性表达对缺血再灌注后海马神经元有保护作用，其作用机制可能是IL-6产生和表达促进星形胶质细胞生长，增加神经生长因子的释放，促进儿茶酚胺能和胆碱能神经元的存活，抑制IL-1及TNF-α的合成，对抗谷氨酸引起的细胞损伤［6，7］，IL-6通过与其受体结合，识别信号转导成分gp130，形成具有生物活性的三元复合体，激活JAK/STAT信号通路，诱导相关基因的表达，进而发挥其多元化神经营养功能［8］。同时我们研究也说明，TNF-α对缺血再灌注后海马神经元有损伤作用，这与Yang等［9］、Lavine等［10］的实验研究结果相同，其作用机制可能是促使细胞间黏附分子的表达，引起白细胞在缺血病灶的聚集；直接或者通过诱导神经毒性介质如ＮＯ的产生而导致梗死病灶的进展［11］；增加核转录因子（NF-κB）的活性，通过复杂信号系统后，可诱导细胞凋亡［12］。其具体的作用机制还需进一步研究。

　　局灶性脑缺血再灌注后，炎性细胞因子在继发性脑损伤中起着非常重要的作用，对脑缺血再灌注后神经细胞发挥神经营养、神经保护及神经毒性双重作用。电针可降低MCAO再灌注模型大鼠海马组织TNF-α的水平，升高IL-6的水平，减少炎症反应引起继发的神经元损伤，可能是电针抗局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡的机制之一。

　　【参考文献】

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　　6  Yamada M，Hatanaka H.Interleukin-6 protects culture rat hippocampal neurons against glutamate induced cell death.Brain Res，1994，643（4）：169-173.

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　　8  肖岚，黎杏群.白介素-6与脑缺血损伤，国外医学·神经病学神经外科学分册，2000，27（5）：258-261.

　　9  Yang GY，Gong C，Qin Z，et al.Inhibition of TNF-αlpha attenuats infarct volume and ICAM-1 expression in ischemic mousebrain.Neuroreport，1998，19（3）：2131-2134.

　　10  Lavine SD，Hofman FM，Zlokovic BV.Circulating antibody against tumor necrosis factor-a protects rat brain from reoerfusion injury.J Cereb Blood Fiow Metab，1998，18（1）：52-58.

　　11  Carlson NG，Bacchi A，Rogers SW，et al.Nicotine blocks TNF-α mediated neuroprotection to NMDA by an α-bungarotoxin sensitive pathway.J Neurobiol，1998，35（1）：29-36.

　　12  McCarthy JV，Ni J，Dixit VM.RIP2 is a novel NF-κB activating and cell death inducing kinase.J Biol Chem，1998，273（27）：16968-16975.

　　基金项目：湖北省自然科学基金资助（编号：2003ABA154）

　　作者单位： 430061 湖北武汉，湖北中医学院

　　(编辑：李建伟)