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【摘要】 目的 探讨反义寡核苷酸是否能抑制H-2Kd在小鼠脾细胞表面的表达。方法 设计合成互补于BALB/C小鼠H-2Kd的反义寡核苷酸并作用于脾LAK细胞，流式细胞术检测靶蛋白的表达率。结果 反义寡核苷酸转染后靶蛋白抑制率明显下降。结论 反义寡核苷酸能明显抑制靶蛋白的表达，从而为进一步研究淋巴细胞表面H-2Kd的功能奠定实验基础。
【关键词】 反义寡核苷酸；H-2K；小鼠；基因敲除
The special silence of H-2Kd gene by antisense oligonucleotides in mouse spleen LAK cells
SHAN Ningning，ZOU Xiong，ZHUANG Xuewei，et al.Clinical Laboratory，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China
【Abstract】 Objective To examine whether this antisense oligonucleotides（ASON） method is useful for silencing the expression of protein H-2Kd on lymphocyte.Methods We prepared ASON targeted BABL/c mouse H-2Kd and applied it into spleen lymphocytes，the targeted molecule was examined by flow cytometry（FCM）.Results The suppression level of the targeted protein reduced significantly.Conclusion Our present result strongly suggest that ASON method enable us to suppress the expression of H-2Kd，which provide an experimental foundation to investigate the function of H-2Kd in lymphocyte membrane.
【Key words】 antisense oligonucleotides；H-2K；mice；knockout
免疫学上突破性进展是提出了主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）在免疫应答中的核心作用，T细胞受体识别MHC和肿瘤抗原的复合体，是激活机体抗肿瘤免疫第一步。我们既往的工作［1，2］表明了肿瘤病人普遍存在淋巴细胞表面MHC-I下降，为了进一步研究宿主淋巴细胞MHC-I在肿瘤免疫中的作用，我们设计合成了小鼠MHC-I（即H-2K）的ASON作为基因封条，为构建H-2Kd降低的动物模型提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 RPMI1640培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司）；淋巴细胞分离液（上海试剂公司）；PE标记的抗H-2Kd单克隆抗体及同型对照（美国PharMingen公司）。FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。
1.2 反义寡核苷酸的合成与修饰 选择互补于BALB/C小鼠H-2Kd基因翻译起始密码及其后17个碱基序列，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）合成反义寡核苷酸（5’-AGCAGCGTGCAGGGTGCCAT-3’），设置随机序列（5’-CGTCAACTCGATGATT-3’）作为对照。由上海博亚生物技术有限公司合成并进行硫代化修饰，纯度＞99%。
1.3 细胞培养 常规无菌制备BALB/C小鼠脾细胞悬液，加入淋巴细胞分离液中，2000r/min离心20min，吸取淋巴细胞层，用不含胎牛血清的RPMI1640培养液洗涤3遍，收集淋巴细胞后，用含10%胎牛血清的RPMI1640稀释至浓度为1×109个/L，37℃，5%CO2中培养48h。
1.4 细胞悬液分组 将细胞悬液分为7组（每组5份），分别加入ASON 5、10、15、20、25μmol/L，标为2、3、4、5、6组，同时设空白对照组（1组）和无关序列组（加入随机寡核苷酸20μmol/L，7组）。72h时2~6组补加半量反义寡核苷酸，对照组不做处理，7组补加10μmol/L的随机序列，继续培养48h。
1.5 流式细胞术检测细胞表面H-2Kd蛋白的表达 取细胞悬液100μl。与PE标记的抗小鼠H-2Kd单抗在37℃下孵育30min，同时设同型对照，流式细胞仪上检测加入反义核酸后LAK细胞表面H-2Kd表达的变化。上述LAK细胞制备及ASON作用实验重复3次，流式细胞仪检测。
1.6 统计学方法 采用SPSS 8.0软件包进行分析，数据先经正态分布检验和方差齐性检验，若符合正态分布和方差齐性的条件，则进行单项方差分析。
2 结果
无关序列组LAK细胞表面H-2Kd表达率为（91.3±1.9）%，与正常对照组（90.1±4.4）%差异无显著性，加入ASON各组的细胞表面H-2Kd均有不同程度的下降，以ASON浓度在15μmol/L时抑制效果最为明显（79.8±2.5）%（P<0.001），随着浓度增加并未增加抑制率（见表1、图1）。 表1 ASON对LAK细胞表面H-2Kd表达的抑制作用 注：A峰：ASON组（4组）；B峰：正常对照组 （1组）A峰H-2Kd的阳性百分率（79.8%）相对B峰（90.1%）降低 图1 FCM检测LAK细胞表面流式细胞H-2Kd的荧光直方图
3 讨论
本课题组研究MHC与肿瘤免疫的关系中发现肿瘤表面MHC－Ⅰ类分子表达下调与肿瘤的发生、分化、转移有关［1］，而且流式细胞术检测发现胃癌、肝癌病人除了癌细胞表面MHC－I下调外，淋巴细胞的MHC－I也有明显的下降［2］。应用RT-PCR法测定外周血淋巴细胞中MHC的工作中除了证实肿瘤细胞表面MHC普遍下降外，发现部分癌症患者表现为外周淋巴细胞MHC下降，且主要表现在HLA－B位点。近年国外发表了一些和我们工作很相近的报道，Le Morvan［3］发现老年人免疫功能下降和外周淋巴细胞MHC－I mRNA（HLA－A、HLA－B，P＜0.0025）抗原下调有关。为进一步探讨宿主MHC的状态与肿瘤免疫的关系，本课题组拟采用基因阻断技术封闭宿主MHC－I的表达，以便进一步研究其与肿瘤免疫的关系。
目前，基因的阻断主要在DNA和mRNA两个水平。前者主要指基因敲除技术，后者主要有反义技术、肽核酸及RNAi。基因敲除往往需要较长时间才能了解所缺失功能基因后的生物学现象，且技术要求和花费都较高；反义核酸技术是根据核酸间碱基配对原则，人工合成或生物合成特定的DNA或RNA序列，导入靶细胞后，可与mRNA或靶基因特异性结合，从而抑制或封闭异常或高表达的基因，使其丧失活性，达到基因控制的目的。
小鼠的MHC位于第17号染色体上，即H-2复合体，BALB/C小鼠H-2的基因型为H-2d，我们从美国国立图书馆的GENEBANK数据库检索小鼠H-2Kd的cDNA序列中（序列号为U47329）的1540个碱基的靶mRNA，选择互补于基因翻译起始密码及其后17个碱基序列，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）合成反义寡核苷酸（5′-AGCAGCGTGCAGGGTGCCAT-3′），并使用NCBI服务器的BLAST将可能的靶位点和相应的基因组数据库（小鼠）进行对比，没有超过16~17个邻近碱基与该编码序列有同源性。流式细胞仪测定证实经ASON处理过的鼠LAK细胞表面H-2Kd的表达率下降，表明ASON进入细胞抑制了H-2Kd基因的表达，减少了H-2Kd蛋白的表达。H-2Kd无同源性的无关序列作用后，LAK细胞表面H-2Kd蛋白表达不受影响，表明ASON对H-2Kd蛋白的抑制作用是特异性的。倒置显微镜下观察，细胞形态也没有明显改变。实验显示，ASON的最佳浓度为15μmol/L，H-2Kd蛋白的表达率降低最明显。
本研究独立设计合成小鼠H-2Kd分子的siRNA，成功封闭了脾LAK细胞靶蛋白，为进一步研究宿主MHC-I的状态在肿瘤免疫中的作用奠定了实验方法和技术理论的基础。
【参考文献】
1 Wang CX，Zou X，Wang LF，et al.Expression of MHC antigen in tissues and peripheral blood lymphocytes of patient with gastric carcinoma.Tumor Marker Oncology，2003，18：37-46.
2 杨晓静，邹雄，王传新，等.外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒感染与细胞表面HLA-I类抗原表达的关系探讨.中华医学杂志，2002，82：1499-1450.
3 Le Morvan C，Cogne M，Drouet M，et al.HLA-A and HLA-B transcripition decrease with aging in peripheral blood lymphocytes.Clin Exp Immunol，2001，125：245-250.
作者单位： 250012 山东济南，山东大学齐鲁医院检验科
（编辑：萧 凝）