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【摘要】 目的 动态观察慢性肝病治疗使用肝炎灵过程中血清胆碱酯酶活性和体外肝炎灵及其组分苦参碱和苦参素对血清胆碱酯酶活性的干预作用，以探讨其作用机制及临床意义。方法 采用每天肌注肝炎灵4 ml并动态观察病人肝功能变化，通过体外肝炎灵和所含双稠哌啶类生物碱成分苦参碱与苦参素及槐定碱与血清共育观察对血清胆碱酯酶活性等肝功指标影响。结果 慢性肝病治疗使用肝炎灵过程中血清胆碱酯酶活性明显进行性下降，与其他肝功能指标改善无相关性，停用肝炎灵后血清胆碱酯酶活性明显回复性升高。体外血清共育实验表明，肝炎灵和苦参碱及特定品牌的高浓度苦参素对血清胆碱酯酶活性有抑制作用。结论 体内外肝炎灵和苦参碱对胆碱酯酶活性有直接抑制作用，而有些品牌的高浓度苦参素对胆碱酯酶活性有一定抑制作用，其原因可能是苦参素质量问题（含有其他的强力胆碱酯酶活性抑制剂）或保存不当致苦参素变质（转化为强力胆碱酯酶活性抑制剂）所致。苦参类生物碱体内用药致血清胆碱酯酶明显下降原因是其在人体内可经过代谢转化成为具有强力抑制胆碱酯酶活性的代谢产物或转化产物。
【关键词】 肝炎灵；双稠哌啶类生物碱；苦参碱；苦参素；胆碱酯酶活性
The clinical observation and the experimental mechanism study of the effect of Ganyanling on serum cholinesterase activity
GUO Xian-zhong，YAN Jian-bin，WANG Zhi-yu，et al.Yuhuan County Hospital of TCM，Zhejiang 535000，China
［Abstract］ Objective To observe the in vitro and in vivo effect and explore the mechanism of Ganyanlin and its quinolizidine alkaloids Matrine and Oxymatrine on serum cholinesterase activity.Methods Ganyanlin was injected intramuscularly 4 ml daily，and the serum cholinesterase activity and other liver function serum index of patients with liver disease were measured weekly.Ganyanlin and its quinolizidine alkaloids such as Matrine，Oxymatrine were incubated with serum in vitro，to measure serum cholinesterase activity.Results After Ganyanlin was injected，the serum cholinesterase activity was progressively downregulated with no relationship to other serum index of liver function，and after Ganyanlin was discontinued，the serum cholinesterase activity was progressively upregulated.By in vitro incubating with serum，the effect of Ganyanlin was same，and it was also found that among its two quinolizidine alkaloids Matrine and Oxymatrine，only Matrine had significant effect in downregulating the serum cholinesterase activity，but some kinds of Oxymatrine at high concentration also in some degree had an effect in downregulating the serum cholinesterase activity.Conclusion In vivo and in vitro Ganyanlin downregulates the serum cholinesterase activity through its component Matrine or other quinolizidine alkaloids which have stronger downregulating effects on serum cholinesterase activity，or / and biotransfering into Matrine or other quinolizidine alkaloids which have stronger downregulating effects on serum cholinesterase activity.In vitro some kind of Oxymatrine at high concentration also in some degree had an effect in downregulating the serum cholinesterase activity due to containing the matter which have downregulating effects on serum cholinesterase activity.In Vivo Matrine or Oxymatrine and other quinolizidine alkaloids may biotransfer into stronger inhibitors of cholinesterase activity.
［Key words］ Ganyanlin；quinolizidine alkaloids；moatrine；oxymatrine；cholinesterase activity
在治疗慢性乙肝的过程中，近年来随着双稠哌啶类生物碱（quinolizidine alkaloids）如苦参碱和氧化苦参碱（苦参素）制剂的广泛应用，临床观察表明在肝功能其他各项指标均有不同程度改善的同时，却可伴有血清胆碱酯酶活性下降［1～5］。考虑肝炎灵（山豆根注射液）中含有大量苦参碱，并以其生物碱苦参碱不少于35 mg/支作为质量控制指标，而因检测方法和山豆根产地不一，文献报道山豆根中苦参素含量是苦参碱的0.6～18倍［6～10］。而肝炎灵中其生物碱主要成分为苦参碱（未发表资料，江苏常熟制药厂提供资料）。鉴于此，在临床实践中笔者对使用肝炎灵的病人进行了治疗前后血清胆碱酯酶活性变化的动态观察，结合其所含的生物碱苦参碱和苦参素成分，进行了体外上述药物与血清共孵育实验，检测其对血清胆碱酯酶活性的影响，以探讨临床上苦参类生物碱致胆碱酯酶活性下降的原因及生物学意义，现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 肝炎灵对肝炎患者血清胆碱酯酶活性影响的检测
1.1.1 病例选择 上海中医药大学附属曙光医院东院肝炎科住院病人随机分成肝炎灵组12例和对照甘利欣组12例，并排除其他心肾重要器官严重疾病者入组。
1.1.2 给药及取样 慢性乙型肝炎患者8例采用肝炎灵（2 ml/支，其中苦参碱含量不低于35 mg/2 ml，江苏常熟制药厂）每日2支一次性肌注，至少观察用药3周以上，对部分病人进行停药后随访。于肝炎灵治疗前、治疗后每周及停药后1～3周抽血常规肝功能检测。对照组5例采用甘利欣治疗（甘利欣50 mg/支，连云港正大天晴制药有限公司），每日150 mg一次性静滴治疗。
1.1.3 指标检测 包括各种常规肝功能指标如谷丙氨酸氨基转移酶（ALT，GPT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST，GOT）、碱性磷酸酶（AKP）、谷氨酰胺转肽酶（GGT）、直接胆红素（DB）和胆碱酯酶（ChE）等，其中ChE检测采用英国Randox公司试剂盒、DB检测采用日本和光纯药工业株式会社试剂盒、其他酶检测采用日本第一化学工业株式会社试剂盒，采用美国雅培Areoset全自动生化分析仪按产品说明和相应程序上机进行检测。
1.2 肝炎灵及其组分苦参碱和苦参素体外对健康人血清胆碱酯酶活性影响的检测
1.2.1 药物 肝炎灵注射液（2 ml/支，其中苦参碱含量不低于35 mg/2 ml），江苏常熟制药厂，批号0502021［肝炎灵（苏）］；苦参素粉针剂（200 mg/支），吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司，批号20041201［苦参素（吉）］；苦参碱注射液（50 mg/5 ml），广州明兴制药有限公司，批号040903-3［苦参碱（粤）］；苦参素葡萄糖注射液（0.6 g/100 ml），江苏正大天晴药业股份有限公司，批号0508221［苦参素（苏）］；苦参素葡萄糖注射液（0.6 g/100 ml），四川美大康佳乐药业有限公司，批号05041531［苦参素（川）］；苦参碱葡萄糖注射液（150 mg/250 ml），江苏正大天晴药业股份有限公司，批号0504181［苦参碱（苏）］；苦参碱和苦参素，宁夏丰利源生物化工制品有限公司提供，纯度98%以上［苦参碱（银）和苦参素（银）］。
1.2.2 血清 浙江省台州市玉环县中医院检验科收集的血清混合。
1.2.3 试剂 血清胆碱酯酶活性检测试剂采用北京利德曼公司试剂盒（批号503011）。
1.2.4 药物配制 按有关生物碱对胆碱酯酶活性影响的文献设置高浓度和苦参碱、苦参素的人体动力学资料设置低浓度［11，12］。高浓度液是用5%葡萄糖液将肝炎灵、苦参素和苦参碱稀释配制成浓度为1 mg／ml，另外还将广州明兴制药有限公司苦参碱注射液用5%葡萄糖液稀释配制成浓度为0.6 mg／ml以便与0.6 mg／ml天晴苦参碱5%葡萄糖液相比较。低浓度液（2 μg／ml）将上述高浓度液采用注射用水进行稀释而成。
1.2.5 检测方法 取各药物的高、低浓度液与等量混合血清混匀，一式三份，将混有药物血清置37 ℃水浴中孵育10 min和24 h，以不含药而只加等体积的稀释液为对照，取样采用HITACHI 7080全自动生化分析仪（日立公司产品）按试剂厂家试剂盒说明书设置参数进行胆碱酯酶活性检测。
1.3 统计学处理 数据采用微机全部输入SPSS数据库，计量资料齐性检验后进行方差分析和两两比较和相关性分析。
2 结果
2.1 肝炎灵对肝炎患者血清胆碱酯酶活性影响 见表1。虽每例患者使用肝炎灵后血清胆碱酯酶活性进行性下降，因肝炎灵组内差异太大（治疗前2700～7400 u/L），致肝炎灵不同时期各组间胆碱酯酶活性差异无统计学意义。对部分使用肝炎灵的病人停药观察发现，血清胆碱酯酶活性随停药时间延长而不断回复性上升。另外血清胆碱酯酶活性的变化与肝功能其他指标变化没有相关性。
2.2 肝炎灵及其组分苦参碱和苦参素体外对健康人血清胆碱酯酶活性影响 见表2。表1 肝炎灵对肝炎患者血清胆碱酯酶活性影响 表2 药物作用后血清胆碱酯酶活性的变化注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
临床观察表明，肝炎灵使用后肝炎病人血清胆碱酯酶活性下降，但停药后恢复性上升。体外药物与血清共育实验表明，肝炎灵和某些品牌的苦参碱或苦参素可致血清胆碱酯酶活性明显下降，说明肝炎灵中有不同程度的强力胆碱酯酶抑制剂诸如有毒性生物碱金雀花碱（Cytisine，Lupinidine，野靛碱，鹰爪豆碱）和臭豆碱（Monolupine，安那吉碱，Anagyrine，安纳基林）及其衍生物等存在［13～15］，因此笔者不赞同有的实验研究报道中认为是因为苦参类生物碱对肝细胞的胆碱酯酶抑制所致这一推测 ［1］。另外，特定品牌的苦参碱或苦参素体外所致的血清胆碱酯酶活性明显下降，其最大可能的原因是因为产品质量问题（即因产品不纯而含有少量金雀花碱、臭豆碱及其衍生物等一类强力胆碱酯酶抑制剂）或保存不当（致苦参素变质而转化成为强力胆碱酯酶抑制剂）所致，一些相当于血药浓度的、低浓度的苦参碱或苦参素体外对血清胆碱酯酶活性没有明显作用，而临床患者使用同一品牌产品制剂后血清胆碱酯酶活性却明显下降，可能是每批产品质量不一，但结合有关报道，更可能是苦参碱或苦参素在人体内可经过生物转化而代谢成为具有强力抑制胆碱酯酶活性的代谢产物或转化产物［3］。事实上，山豆根经加工处理制成的肝炎灵注射液，其苦参素或处理缺失或经处理为其他抗氧化剂所还原为苦参碱，致肝炎灵绝大部分生物碱为苦参碱所证明（未发表资料，江苏常熟制药厂提供资料）。
胆碱酯酶是一类催化酰基胆碱水解的酶类，故又称酰基胆碱水解酶。按照酶水解底物的专一性、水解速度的差异、对抑制剂敏感性以及组织分布特点，体内胆碱酯酶分为两种：一种为乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7），又称真性胆碱酯酶（True cholinesterase）；另一种为丁酰胆碱酯酶（Butylcholinesterase，BuChE，EC3.1.1.8），也称假性、拟胆碱酯酶。本研究所测的血清胆碱酯酶主要为后者，是由肝细胞合成并分泌的，因此反映肝细胞合成功能状况。临床上，血清胆碱酯酶活性检测主要用于协助肝病和痴呆病的诊断和鉴别诊断以及有机磷与氨基甲酸酯农药中毒诊断，另外有报道肿瘤、急性肾炎、营养不良、急性感染性疾病、登革热、贫血、烧伤、肺心病、心肌梗死、风湿性心脏病、结缔组织疾病、消化性溃疡、克丁病、高热、结核、休克、先天愚型、节段性回肠炎、胆囊息肉、饥饿和镉中毒亦有下调变化。但不容置辨，药物通过抑制血清胆碱酯酶活性或减少肝内胆碱酯酶的合成所致的医源性（药物性）血清胆碱酯酶改变亦是一个不容忽视的问题，这些药物包括有机磷化合物、某些抗癌药、单胺氧化酶抑制剂、吗啡类、局麻药、糖皮质激素、肾上腺素、雌激素、避孕药、Vit B1、Vit D2、Vit K、叶酸、氯化四乙胺、阿米妥钠、咖啡因、茶碱、可可碱、毒毛旋花苷、氯仿、对硝基苯甲酸、季胺化合物、蝎毒、抗疟疾药、巴比妥钠、胆碱类、阿托品、可待因、酚噻嗪类、解热镇痛药、对硝基苯磺酰胺、（-），（+）黄皮酰胺、西咪替丁、灭吐宁、夏天无总碱等［16～20］。另外保肝药的甘草酸和甘草次酸所致乙酰胆碱酯酶活性抑制亦有报道［21］。本研究再次强调，血清胆碱酯酶活性测定在临床诊治意义有限，应注意医源性（药物性）血清胆碱酯酶活性变化对临床诊疗带来的干扰。
苦参类生物碱是从槐科植物苦豆、苦参或山豆根中提取的双稠哌啶类生物碱，苦豆草和中药中属于小毒的山豆根及最近发现对小鼠急性毒性LD50低于山豆根（40.06 g/kg）的苦参（9.36 g/kg）［22～24］，其主要毒性成分之一是生物碱，尤其是其中的苦参碱和金雀花碱的神经毒性，虽然上述生物碱的杀虫活性与其说与抑制胆碱酯酶活性不正相关［13］，还不如说与其他代谢酶正相关，如抑制羧酸酯酶活性正相关［14，15］，正因为其杀虫生物学活性上述生物碱被农、林业部门作为植物源性、生态绿色杀虫剂即农药而广泛应用，另还有研究认为苦参碱因其对鼠类的明显毒性可作为杀鼠剂使用［25］。另外考虑临床应用山豆根或苦参过量误服致明显消化道状等毒蕈碱样症状和烟碱样症状（与其胆碱酯酶活性的抑制作用有关）外［26，27］，最主要的症状便是中枢神经系统毒性［28～31］，考虑不同昆虫和病原菌的代谢过程有不同的特征，其对不同生物碱的不同敏感性，如杀线虫上含有仲胺型氮原子的苦豆碱比含叔胺型氮原子的脱氢苦豆碱具更强的杀线活性［28］，而且对线虫的毒力强弱顺序苦豆碱＞槐果碱＞槐胺碱＞苦参碱［29］，而对韭蛆的毒力强弱顺序则是脱氢苦豆碱＞苦参碱＞槐定碱＞氧化苦参碱＞苦豆碱［13］，触杀阴道毛滴虫作用强弱顺序则是苦参碱＞氧化苦参碱＞苦豆碱子总碱，而槐果碱和槐定碱未显有作用［30］，说明不同的苦参类生物碱对不同的病害虫可能有各自不同的特征性干预作用，因此研究不同生物碱对人体内诸多代谢酶活性的干预作用特别是对羧酸酯酶活性的抑制与对机体毒性关系极有临床意义。
*基金项目：上海市科委课题 “常见苦参类生物碱的抗乙肝病毒复制和降酶退黄作用的比较研究”（NO：2004 ZR14132）
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作者单位：1 317600 浙江台州，台州市玉环县中医院 2 535000 广西钦州，钦州市中医院（进修生）3 201203 上海，上海中医药大学研究生院（博士生）4 201203 上海，上海中医药大学附属曙光医院